一种包埋体复合杀虫益生菌剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种包埋体复合杀虫益生菌剂及其制备方法和应用，属于土壤调理剂制备技术领域

技术背景

高层建筑庭院(城市森林花园)，节约土地资源，提高城市绿化率，人居环境优良，具有很好的环保、社会和经济价值。但是在敞开式的高层庭院中种植园林植物，其产生一系列问题：a)庭院垃圾(树叶树枝等)清理较之传统庭院清理更加困难，长期不清理生腐臭气体，破坏庭院景观及感官体验；b)高层庭院园林垃圾中易滋生虫蝇，给居住的人体健康造成威胁；c)由于高层建筑庭院承载力受限，种植土厚度比传统庭院较薄，保水保肥较差，给庭院植物生长带来困难。

处理庭院垃圾，传统的处置方式是填埋和焚烧，很少部分进行资源化利用，需要专用的处理、处置场所。且有直接填埋和简单焚烧会产生占地、烟尘等问题。有价值的庭院垃圾有机质并未得到有效利用。

另一方面，高层庭院建筑土壤肥力保持措施，依靠土壤种植前的底肥及追加化肥。在庭院建设完成后，给高程庭院的土壤追肥困难，也需要耗费较大的人工及费用。

目前高层庭院，解决庭院垃圾的方法为定期清理，异位集中处理，需要消耗较多人力物力用于庭院垃圾的收集、运输过程。而土壤中的营养成分随庭院垃圾的清理而带走，往往又需要通过定期补充肥料而得以补充，同样需要耗费购肥、运输、施肥等成本。

另一方面，高层庭院如不及时清理庭院垃圾，有机质腐烂变质易滋生蚊虫，传统处理方法是定期喷洒杀虫剂，不利于居住人员身体健康。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种球状微胶囊状，具有缓释效果的一种包埋体复合杀虫益生菌剂及其制备方法和应用，本发明结合原位降解微生物制剂及抑虫剂，通过包埋的方法，释放于庭院土壤中，缓释原位降解庭院垃圾，并为庭院植物提供营养物质，同时抑制蚊虫滋生。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明一种包埋体复合杀虫益生菌剂的制备方法，包括如下步骤：

步骤一菌剂复壮

在灭菌瓶中接种em菌剂、bt混合菌，然后放入蜜糖，再加入水，获得混合液，然后将混合液密封储存，于磁力搅拌下发酵，发酵时间≥7天，测试ph≤3.5，获得复壮菌液；将复壮菌液离心，所得固相用生理盐水稀释至8-12g/l获得浓缩菌液；

步骤二菌剂包埋

浓缩菌液中加入保护剂，获得含保护剂的菌剂，将含保护剂的菌剂与内壁材料混合，获得菌剂微球，再将菌剂微球与外壁材料混合获得糊状浆料，将糊状浆料进行真空冻干，即得包埋体复合杀虫益生菌剂；所述内壁材料为多孔淀粉；所述外壁材料为含海藻酸钠、糊精、明胶的混合物。

在本发明中，em菌剂为己经商业化的菌剂，其含五大类多种益生微生物，通过光合菌、乳酸菌、酵母菌、革兰氏阳性放线菌及发酵系的丝状菌多种微生物。

本发明所用em菌剂购买于安徽广宇生物技术有限公司em菌种原种em菌剂为液态，其有效成分含量为107～108cfu/ml。

bt混合菌为己经商业化的菌剂，主要混有苏云金杆菌库斯塔克亚种(bacillusthuringiensissubsp.kurstaki)、青虫菌(b.t.subsp.galleriae)、杀螟杆菌(bacilluscereus)三个芽孢杆菌菌种，生物量比例为1:1:1，以消灭食叶害虫及嗜土害虫。

在发明中所述bt混合菌购买于购买于湖北农科谷生态科技无限公司，为浓缩型乳剂，平板菌落计数法测试，其孢子含量≥1010cfu/ml。

发明人发现，将两种菌剂其同复壮的效果要优于将两种菌剂分别复壮再混合的效果。

优选的方案，步骤一中，所述混合液中，按体积比计，em菌剂：bt混合菌：蜜糖：水＝1.5-2.5:0.5-1.5:2.5-3.5:90-100。

优选的方案，步骤一中，密封储存的温度为25-30℃。

在实际操作过程中，密封储存，在磁力搅拌下缓慢发酵，7天后，测试ph≤3.5；并伴有酸甜气味表示菌种复壮成功，检测采用平板记数法确定生物量达到108cfu/ml以上。

优选的方案，步骤一中，复壮菌液离心的转速为2500-3500r/min，离心的时间为15-30min。

优选的方案，步骤二中，所述保护剂的组成为：按质量比计：乳清粉:甘油:蔗糖为4-6:0.5-1.5:4-6。本发明人的保护剂可以保障菌剂活性耐贮存性。

优选的方案，步骤二中，所述保护剂与浓缩菌液的固液质量体积比为0.15～0.3g：1ml。

优选的方案，步骤二中，含保护剂的菌剂与内壁材料混合的过程为：将内壁材料加入含保护剂的菌剂中，以50～100r/min搅拌30～60min，即得菌剂微球。在上述操作中，多孔淀粉可充分的吸附菌剂。

在本发明中包埋工艺中，多孔淀粉形成复合杀虫益生菌剂的内壁，吸附固定菌体。

优选的方案，步骤二中，所述浓缩菌液与内壁材料的液固体积质量比为1ml：0.6～1.2g。

优选的方案，步骤二中，所述外壁材料中，按质量比计，海藻酸钠:明胶:糊精为1.5～2.5:3.5～4.5:4～6。

优选的方案，步骤二中，所述外壁材料与浓缩菌液的固液质量体积比为0.03～0.06g:1ml。

在本发明中包埋工艺中，外壁材料形成复合杀虫益生菌剂的外壁，外壁提供强度及保护层，充分保障了包埋体的结构强度及内部菌体活性，也提供了缓释性能，保障菌剂作用的长效性。

优选的方案，步骤二中，所述糊状浆料于10℃以下进行真空冻干，至含水率≤5％，即得包埋体复合杀虫益生菌剂

本发明还提供上述制备方法所制备的一种包埋体复合杀虫益生菌剂。

本发明还提供上述制备方法所制备的一种包埋体复合杀虫益生菌剂的应用，将包埋体复合杀虫益生菌剂应用于生态庭院的种植土中。

在应用过程中，将包埋体复合杀虫益生菌剂掺入庭院用种植基质中即可，有益效果

本发明所提供的复合微生物菌剂通过包埋工艺将菌剂包封在选择性透过膜中，形成球状微胶囊，起缓释、提高适应性、长效性的效果，在在高层庭院建设时，按一定比例接种掺入庭院园林用土中，可以促进庭院垃圾的降解，抗虫，抑制蚊蝇等害虫活动。

本发明所制备的包埋体复合杀虫益生菌剂相当于现有技术的优点为：

1、包埋体材料均为天然化合物，安全无毒，适用于住宅庭院此类与人体密切接触的环境。

2、菌剂杀虫及益生菌体均为有较长使用历史，已被证明对人体安全的菌种，因此适用于住宅庭院此类与人体密切接触的环境。

3、采用内外两层包埋壁结构，内层壁吸附固定菌体，外层壁提供强度及保护层，充分保障了包埋体的结构强度及内部菌体活性，也提供了缓释性能，保障菌剂作用的长效性。

4、菌剂制作过程中采用低温冻干及保护剂的加入，保障了菌剂活性的保持，便于提高使用后菌剂生物量提高，从而使得菌剂功能性效果更加显著。

具体实施方式

实施例1

1、复壮菌种选择：采购商品bt菌剂及em菌剂，包装标称有效孢子(菌)数为：≥1010cfu/ml和108cfu/ml；

2、菌种复壮：于实验室500ml灭菌三角瓶中接种6mlem菌液、3mlbt混合菌剂，并放入蜜糖9ml，加水至300ml，同样方法接种5瓶共计1500ml。

至于28℃培养箱，摇床缓慢发酵50r/min，7天后，测试ph为3，且并伴有酸甜气味表示菌种复壮成功，采用平板记数法检测生物量达到3×1010cfu/ml。

3、菌剂离心液制备：将制备的复壮菌液，置于3000r/min低温离心20min，撇去上清液，离心机沉淀物(菌体)用生理盐水稀释至10g/l后，获得500ml浓缩菌液。

4、包埋体材料配制及制作：

预加保护剂：500ml浓缩菌液中加入乳清粉45g、甘油10g、蔗糖为45g；

制备缓释菌剂微球：

(2)制备缓释菌剂微球：加入400g多孔淀粉，以60r/min速度搅拌60min，使其充分吸附后，制成菌剂微球；

(3)制作外壁材料：加入海藻酸钠5g、明胶10g、糊精11g，加入搅拌均匀成糊状。

5、包埋体制作：将上述糊状物盛于不锈钢盘中，进入真空低温冻干机，10℃以下干燥至含水率≤5％，即完成包埋体菌剂制作，得到约1.2kg包埋体菌剂。

6、按照2％(w/w)掺入比例，投加于种植土中使用。

7、掺入种植土在20℃下培育1周，对包埋体周边≤30cm厚土壤进行取样，按1kg土:1l水的比例于三角瓶中浸泡制成悬浊液时，取上清液进行点滴法实验，ld50约500μg/头。

8、掺入种植土后，测试包埋体菌剂对降解庭院垃圾效果，在土中掺入3％(w/w)以庭院垃圾(树叶)为主的物料，对照组为未掺入包埋体菌剂的样品掺入同比例庭院垃圾，在温度约20℃条件下培育3周，检测土壤中庭院垃圾中菌群浓度，掺入包埋体的比对照组高100倍，实验组数量级为105cfu/mg，对照组为103cfu/mg。

9、小区实验中，7、8条所阐述的杀虫效应及菌种活性在6月后仍保持，表明缓释效果在实际应用中有效，且种植玉米10株相比对照组，在生物量(重量)上比对照组平均多7～10％，株高和植株径均比对照组高3～5％、粗3～5％。

对比例1—分别复壮(杀虫性能有所下降)

1、复壮菌种选择：采购商品bt菌剂及em菌剂，包装标称有效孢子(菌)数为：≥1010cfu/ml和≥108cfu/ml；

2、菌种复壮：于实验室两个500ml灭菌三角瓶中分别接种6mlem菌液、3mlbt混合菌剂，并放入蜜糖9ml，加水至300ml，同样方法接种5瓶共计1500ml；

两种菌分别至于28℃培养箱，摇床缓慢发酵50r/min，7天后，测试ph为3，且并伴有酸甜气味表示菌种复壮成功，采用平板记数法检测em菌的生物量达到1010cfu/ml，bt菌生物量达108cfu/ml。

3、菌剂离心液制备：将制备的复壮em、bt菌液，分别置于4000r/min低温离心20min，撇去上清液，离心机沉淀物(菌体)用生理盐水稀释至10g/l后，获得500ml浓缩菌液，再将两种浓缩菌液按1:1(w/w)的比例混合菌液制成混合混合菌液。

4、包埋体材料配制及制作：

预加保护剂：取500ml混合浓缩菌液中加入乳清粉45g、甘油10g、蔗糖为45g；

制备缓释菌剂微球：

(2)制备缓释菌剂微球：加入400g多孔淀粉，以60r/min速度搅拌60min，使其充分吸附后，制成菌剂微球。

(3)制作外壁材料：加入海藻酸钠5g、明胶10g、糊精11g，加入搅拌均匀成糊状。

5、包埋体制作：将上述糊状物盛于不锈钢盘中，进入真空低温冻干机，10℃以下干燥至含水率≤5％，即完成包埋体菌剂制作，得到约1.2kg包埋体菌剂。

6、按照2％(w/w)掺入比例，投加于种植土中使用。

7、掺入种植土在20℃下培育1周，对包埋体周边≤30cm厚土壤进行取样，按1kg土:1l水的比例于三角瓶中浸泡制成悬浊液时，取上清液进行点滴法实验，ld50约1000μg/头。

8、小区实验中，种植玉米10株相比对照组，在生物量(重量)上比对照组平均多5～7％，株高和植株径均比对照组高2～3％、粗2～3％。

对比例2——改变保护剂及脱水工艺(生物量有所下降)

1、复壮菌种选择：采购商品bt菌剂及em菌剂，包装标称有效孢子(菌)数为：≥1010cfu/ml和108cfu/ml；

2、菌种复壮：于实验室500ml灭菌三角瓶中接种6mlem菌液、3mlbt混合菌剂，并放入蜜糖9ml，加水至300ml，同样方法接种5瓶共计1500ml。

至于28℃培养箱，摇床缓慢发酵50r/min，7天后，测试ph为3，且并伴有酸甜气味表示菌种复壮成功，采用平板记数法检测生物量达到3×1010cfu/ml。

3、菌剂离心液制备：将制备的复壮菌液，置于3000r/min低温离心20min，撇去上清液，离心机沉淀物(菌体)用生理盐水稀释至10g/l后，获得500ml浓缩菌液。

4、包埋体材料配制及制作：

制备缓释菌剂微球：

(2)制备缓释菌剂微球：加入400g多孔淀粉，以60r/min速度搅拌60min，使其充分吸附后，制成菌剂微球；

(3)制作外壁材料：加入海藻酸钠5g、明胶10g、糊精11g，加入搅拌均匀成糊状。

5、包埋体制作：将上述糊状物盛于不锈钢盘中，进入常温烘干机，25℃以下干燥至含水率≤6％，即完成包埋体菌剂制作，得到约1.5kg包埋体菌剂。

6、按照2％(w/w)掺入比例，投加于种植土中使用。

7、掺入种植土在20℃下培育1周，对包埋体周边≤30cm厚土壤进行取样，按1kg土:1l水的比例于三角瓶中浸泡制成悬浊液时，取上清液进行点滴法实验，ld50约1000μg/头。

9、小区实验中，种植玉米10株相比对照组，在生物量(重量)上比对照组平均多6～8％，株高和植株径均比对照组高3～5％、粗3～5％。

对比例3——改变包埋剂配比(综合性能所下降)

1、复壮菌种选择：采购商品bt菌剂及em菌剂，包装标称有效孢子(菌)数为：≥1010cfu/ml和≥108cfu/ml；

2、菌种复壮：于实验室500ml灭菌三角瓶中接种6mlem菌液、3mlbt混合菌剂，并放入蜜糖9ml，加水至300ml，同样方法接种5瓶共计1500ml。

至于28℃培养箱，摇床缓慢发酵50r/min，7天后，测试ph为3，且并伴有酸甜气味表示菌种复壮成功，采用平板记数法检测生物量达到3×1010cfu/ml。

3、菌剂离心液制备：将制备的复壮菌液，置于3000r/min低温离心20min，撇去上清液，离心机沉淀物(菌体)用生理盐水稀释至10g/l后，获得500ml浓缩菌液。

4、包埋体材料配制及制作：

(1)预加保护剂：500ml浓缩菌液中加入乳清粉45g、甘油10g、蔗糖为45g；

制备缓释菌剂微球：

(2)制备缓释菌剂微球：加入400g多孔淀粉，以60r/min速度搅拌60min，使其充分吸附后，制成菌剂微球；

(3)制作外壁材料：加入海藻酸钠15g、明胶30g、糊精30g，加入搅拌均匀成糊状。

5、包埋体制作：将上述糊状物盛于不锈钢盘中，进入真空低温冻干机，10℃以下干燥至含水率≤5％，即完成包埋体菌剂制作，得到约1.2kg包埋体菌剂。

6、按照2％(w/w)掺入比例，投加于种植土中使用。

7、掺入种植土在20℃下培育1周，对包埋体周边≤30cm厚土壤进行取样，按1kg土:1l水的比例于三角瓶中浸泡制成悬浊液时，取上清液进行点滴法实验，ld50约1200μg/头。

8、掺入种植土后，测试包埋体菌剂对降解庭院垃圾效果，在土中掺入3％(w/w)以庭院垃圾(树叶)为主的物料，对照组为未掺入包埋体菌剂的样品掺入同比例庭院垃圾，在温度约20℃条件下培育3周，检测土壤中庭院垃圾中菌群浓度，掺入包埋体的比对照组高10倍，实验组数量级为104cfu/mg，对照组为103cfu/mg。

9、小区实验中，7、8条所阐述的杀虫效应及菌种活性在6月后仍保持，表明缓释效果在实际应用中有效，且种植玉米10株相比对照组，在生物量(重量)上比对照组平均多3％以内，株高和植株径均比对照组高3％以内，粗3％以内，差异不明显。

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