一种用于脐带间充质干细胞的冻存保护液制备工艺的制作方法

本发明涉及生物细胞技术领域，具体为一种用于脐带间充质干细胞的冻存保护液制备工艺。

背景技术：

间充质干细胞是来源于发育早期的中胚层和外胚层的成体干细胞，具有高度自我更新和多向分化潜能，存在于骨髓、脂肪等多种结缔组织和器官间质中。间充质干细胞因其组织工程、造血干细胞移植以及基因治疗领域的巨大潜力成为干细胞领域的研究热点。脐带来源的间充质干细胞具有非常高的分化潜能，可以定向诱导分化为骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经等多个组织，并且免疫原性低，取材方便，伦理学争议小，相比于骨髓等其他来源的间充质干细胞，具有更加广泛的应用前景。间充质干细胞具有可以大量扩增的特点，人脐带间充质干细胞过度传代会出现明显的衰老和凋亡，长期体外培养会导致多分化潜能降低，黏附能力下降，细胞凋亡率增加，而且克罗恩病会导致人员发成肠萎等现象，而间充质干细胞的研究和开发使用可以提供了治疗肠萎的新疗法，因此，脐带间充质干细胞也越来越多地被用于治疗克罗恩病等，而对脐带间充质干细胞冷冻保存使其保持良好的分化潜能是脐带间充质干细胞研究和临床应用的重要环节，因此，针对上述问题提出一种用于脐带间充质干细胞的冻存保护液制备工艺。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于脐带间充质干细胞的冻存保护液制备工艺，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种用于脐带间充质干细胞的冻存保护液制备工艺，包括以下步骤：

步骤一：清洗处理：首先使用消毒后的手术剪刀将脐带组织进行剪开和铺开，并且对铺开后的脐带组织进行固定处理，然后使用消毒液对脐带组织的表面进行清理，清理时，使用棉球蘸消毒液对脐带表面进行反复消毒清理，消毒清理的次数为3-5次，然后使用细胞前处理清洗缓冲液对脐带组织进行清洗处理，清洗时，使用棉球蘸缓冲液进行反复清洗，清洗的次数为3-5次，从而有效的降低脐带组织上红细胞的比例，然后对脐带组织进行收集待用；

步骤二：消化处理：然后对步骤一中得到的脐带组织进行剪碎处理，剪碎处理时，控制脐带组织剪碎的大小，使得单块的脐带组织的上端面面积控制在0.08cm2-0.2cm2，然后对剪碎之后的脐带组织内加入胰酶和edta进行消化处理，消化处理时，使得胰酶和edta完全浸没脐带组织，并且在消化处理时，进行反复翻动脐带组织，然后在消化处理之后去除脐带组织，然后在酶解液中加入间充质干细胞培养基，从而终止消化，最后清洗酶解之后得到的细胞，最终获得细胞悬液；

步骤三：细胞培养：对步骤二中得到的酶解消化后的细胞进行离心处理，在离心处理时，采用5000rpm-8000rpm的转速进行离心处理，保证细胞的破裂，然后在完全培养基重选后，进行密度传代，细胞连续生长24h-72h；

步骤四：离心取上清：对步骤三中得到的液体进行离心处理，在离心处理时，采用1500rpm-1800rpm的转速进行离心处理，离心处理的时间为10-15分钟，然后进行取上清备用；

步骤五：冷冻处理：对步骤四中得到的上清中进行加入二甲基亚砜，然后进行混合处理，在混合处理后，然后进行低温过夜保存，最后再转入液氮中进行长期的保存处理。

优选的，所述步骤二中向细胞中加入0.02ml/cm2的0.2％的胰酶和0.03％的edta，并且消化时间为20min。

优选的，所述步骤二中向细胞中加入0.01ml/cm2的0.3％的胰酶和0.04％的edta，并且消化时间为15min。

优选的，所述步骤二中向细胞中加入0.03ml/cm2的0.1％的胰酶和0.02％的edta，并且消化时间为25min。

优选的，步骤三中按照5000个细胞/cm2-8000个细胞/cm2的传代密度进行传代。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明中，通过上述技术工艺，不仅可以有效的避免牛血清的使用，从而尽可能少引入异源的病毒和致敏源，而且可以有效的提高脐带间充质干细胞的冻存保护液的质量。

具体实施方式

实施例1：本发明提供一种技术方案：

一种用于脐带间充质干细胞的冻存保护液制备工艺，包括以下步骤：

步骤一：清洗处理：首先使用消毒后的手术剪刀将脐带组织进行剪开和铺开，并且对铺开后的脐带组织进行固定处理，然后使用消毒液对脐带组织的表面进行清理，清理时，使用棉球蘸消毒液对脐带表面进行反复消毒清理，消毒清理的次数为3-5次，然后使用细胞前处理清洗缓冲液对脐带组织进行清洗处理，清洗时，使用棉球蘸缓冲液进行反复清洗，清洗的次数为3-5次，从而有效的降低脐带组织上红细胞的比例，然后对脐带组织进行收集待用；

步骤二：消化处理：然后对步骤一中得到的脐带组织进行剪碎处理，剪碎处理时，控制脐带组织剪碎的大小，使得单块的脐带组织的上端面面积控制在0.08cm2-0.2cm2，然后对剪碎之后的脐带组织内加入胰酶和edta进行消化处理，消化处理时，使得胰酶和edta完全浸没脐带组织，并且在消化处理时，进行反复翻动脐带组织，然后在消化处理之后去除脐带组织，然后在酶解液中加入间充质干细胞培养基，从而终止消化，最后清洗酶解之后得到的细胞，最终获得细胞悬液；

步骤三：细胞培养：对步骤二中得到的酶解消化后的细胞进行离心处理，在离心处理时，采用5000rpm-8000rpm的转速进行离心处理，保证细胞的破裂，然后在完全培养基重选后，进行密度传代，细胞连续生长24h-72h；

步骤四：离心取上清：对步骤三中得到的液体进行离心处理，在离心处理时，采用1500rpm-1800rpm的转速进行离心处理，离心处理的时间为10-15分钟，然后进行取上清备用；

步骤五：冷冻处理：对步骤四中得到的上清中进行加入二甲基亚砜，然后进行混合处理，在混合处理后，然后进行低温过夜保存，最后再转入液氮中进行长期的保存处理。

所述步骤二中向细胞中加入0.03ml/cm2的0.1％的胰酶和0.02％的edta，并且消化时间为25min，步骤三中按照5000个细胞/cm2-8000个细胞/cm2的传代密度进行传代，这种设置有效的保证了提高脐带间充质干细胞的冻存保护液的质量。

本发明中，通过上述技术工艺，不仅可以有效的避免牛血清的使用，从而尽可能少引入异源的病毒和致敏源，而且可以有效的提高脐带间充质干细胞的冻存保护液的质量。

实施例2：本发明提供一种技术方案：

一种用于脐带间充质干细胞的冻存保护液制备工艺，包括以下步骤：

步骤一：清洗处理：首先使用消毒后的手术剪刀将脐带组织进行剪开和铺开，并且对铺开后的脐带组织进行固定处理，然后使用消毒液对脐带组织的表面进行清理，清理时，使用棉球蘸消毒液对脐带表面进行反复消毒清理，消毒清理的次数为3-5次，然后使用细胞前处理清洗缓冲液对脐带组织进行清洗处理，清洗时，使用棉球蘸缓冲液进行反复清洗，清洗的次数为3-5次，从而有效的降低脐带组织上红细胞的比例，然后对脐带组织进行收集待用；

步骤二：消化处理：然后对步骤一中得到的脐带组织进行剪碎处理，剪碎处理时，控制脐带组织剪碎的大小，使得单块的脐带组织的上端面面积控制在0.08cm2-0.2cm2，然后对剪碎之后的脐带组织内加入胰酶和edta进行消化处理，消化处理时，使得胰酶和edta完全浸没脐带组织，并且在消化处理时，进行反复翻动脐带组织，然后在消化处理之后去除脐带组织，然后在酶解液中加入间充质干细胞培养基，从而终止消化，最后清洗酶解之后得到的细胞，最终获得细胞悬液；

步骤三：细胞培养：对步骤二中得到的酶解消化后的细胞进行离心处理，在离心处理时，采用5000rpm-8000rpm的转速进行离心处理，保证细胞的破裂，然后在完全培养基重选后，进行密度传代，细胞连续生长24h-72h；

步骤四：离心取上清：对步骤三中得到的液体进行离心处理，在离心处理时，采用1500rpm-1800rpm的转速进行离心处理，离心处理的时间为10-15分钟，然后进行取上清备用；

步骤五：冷冻处理：对步骤四中得到的上清中进行加入二甲基亚砜，然后进行混合处理，在混合处理后，然后进行低温过夜保存，最后再转入液氮中进行长期的保存处理。

所述步骤二中向细胞中加入0.02ml/cm2的0.2％的胰酶和0.03％的edta，并且消化时间为20min，步骤三中按照5000个细胞/cm2-8000个细胞/cm2的传代密度进行传代，这种设置有效的保证了提高脐带间充质干细胞的冻存保护液的质量。

本发明中，通过上述技术工艺，不仅可以有效的避免牛血清的使用，从而尽可能少引入异源的病毒和致敏源，而且可以有效的提高脐带间充质干细胞的冻存保护液的质量。

实施例3：本发明提供一种技术方案：

一种用于脐带间充质干细胞的冻存保护液制备工艺，包括以下步骤：

步骤一：清洗处理：首先使用消毒后的手术剪刀将脐带组织进行剪开和铺开，并且对铺开后的脐带组织进行固定处理，然后使用消毒液对脐带组织的表面进行清理，清理时，使用棉球蘸消毒液对脐带表面进行反复消毒清理，消毒清理的次数为3-5次，然后使用细胞前处理清洗缓冲液对脐带组织进行清洗处理，清洗时，使用棉球蘸缓冲液进行反复清洗，清洗的次数为3-5次，从而有效的降低脐带组织上红细胞的比例，然后对脐带组织进行收集待用；

步骤二：消化处理：然后对步骤一中得到的脐带组织进行剪碎处理，剪碎处理时，控制脐带组织剪碎的大小，使得单块的脐带组织的上端面面积控制在0.08cm2-0.2cm2，然后对剪碎之后的脐带组织内加入胰酶和edta进行消化处理，消化处理时，使得胰酶和edta完全浸没脐带组织，并且在消化处理时，进行反复翻动脐带组织，然后在消化处理之后去除脐带组织，然后在酶解液中加入间充质干细胞培养基，从而终止消化，最后清洗酶解之后得到的细胞，最终获得细胞悬液；

步骤三：细胞培养：对步骤二中得到的酶解消化后的细胞进行离心处理，在离心处理时，采用5000rpm-8000rpm的转速进行离心处理，保证细胞的破裂，然后在完全培养基重选后，进行密度传代，细胞连续生长24h-72h；

步骤四：离心取上清：对步骤三中得到的液体进行离心处理，在离心处理时，采用1500rpm-1800rpm的转速进行离心处理，离心处理的时间为10-15分钟，然后进行取上清备用；

步骤五：冷冻处理：对步骤四中得到的上清中进行加入二甲基亚砜，然后进行混合处理，在混合处理后，然后进行低温过夜保存，最后再转入液氮中进行长期的保存处理。

所述步骤二中向细胞中加入0.01ml/cm2的0.3％的胰酶和0.04％的edta，并且消化时间为15min，步骤三中按照5000个细胞/cm2-8000个细胞/cm2的传代密度进行传代，这种设置有效的保证了提高脐带间充质干细胞的冻存保护液的质量。

本发明中，通过上述技术工艺，不仅可以有效的避免牛血清的使用，从而尽可能少引入异源的病毒和致敏源，而且可以有效的提高脐带间充质干细胞的冻存保护液的质量。

本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，由于文字表达的有限性，而客观上存在无限的具体结构，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进、润饰或变化，也可以将上述技术特征以适当的方式进行组合；这些改进润饰、变化或组合，或未经改进将发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均应视为本发明的保护范围。

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