sPRR

本发明涉及一种探讨肾素活性影响机制的试验方法，尤其涉及一种sprr-his对小鼠呋塞米饮水诱导的肾素活性影响的试验方法。
背景技术：
：circulation的一篇文章公布了关于2012年～2015年中国高血压状况的全国性调查结果。该结果显示，按照2010版《中国高血压防治指南》的标准，18岁以上的中国成年人口中高血压的发病率为23.2％(约2.45亿人)，处于高血压前期的占41.3％(约4.35亿人)。高血压治疗一直是以血压的控制为主，研究发现高血压出现与肾素有关，肾素是人体内最重要的血压调节激素之一。肾素是一种天冬氨酰蛋白酶，它是通过催化肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin-system，ras)活化的第一步也就是血管紧张素原(angiotensinogen，agt)转化为血管紧张素i(angiotensini，angi)这一限速步骤，从而在血压控制和电解质调节中扮演重要的角色。肾脏的肾小球旁(juxtaglomerularapparatuscells，jg)细胞是循环肾素的主要来源。肾脏中肾素的生物合成受多种因素的共同调节，包括氯化钠浓度、血压、交感神经活性和血管紧张素ⅱ(angiotensinⅱ，angⅱ)等。例如袢利尿剂呋塞米可通过抑制肾脏髓袢升支粗段na-k-2cl同向转运蛋白，导致钠离子浓度降低，从而使肾素分泌增加。肾素原受体((pro)reninreceptor，prr)是ras的新成员，它已经成为水盐代谢、血压和肾脏局部ras调节的关键因子。蛋白酶介导prr切割产生细胞外域的可溶性肾素原受体(solubleprr,sprr)。循环系统sprr被广泛认为是许多人类疾病的生物标记，如妊娠糖尿病、肾小管间质纤维化等。在关于弗林蛋白酶(furinprotease)和解整合素样金属蛋白酶19(adam19)作为prr切割酶的争议性研究之后，出现了坚实的证据支持s1p(site1protease，又称为ski-1，pcsk8，mbtps1)作为切割生成sprr的主要蛋白酶。这些结果为未来研究s1p来源的内源性sprr的生物学功能提供了一个新的平台。经过研究发现sprr由集合管闰细胞产生，通过旁分泌的方式影响邻近的主细胞的水钠转运功能，从而对血容量与血压产生调节作用，并阐明了sprr的产生机制。一种重组的、带有组氨酸标记的sprr，称为sprr-his，能通过激活位于集合管主细胞顶膜的frizzled-8受体激动β-连环蛋白(β-catenin)通路，参与水通道蛋白2的调控，影响尿液浓缩功能。研究发现s1p酶来源的sprr可以靶向血管加压素v2受体，从而增强小鼠尿液浓缩能力。另外，研究发现s1p对于醛固酮诱导的上皮钠离子通道蛋白(epithelialsodiumchannel,enac)激活也是必要的。尽管通过研究已经发现sprr在高血压和肾脏水钠潴留的调节中可能发挥重要作用，但目前这方面的发现和研究仍然还是都非常有限。研究发现肾单位特异性敲除prr小鼠血浆中的肾素活性与野生型小鼠相比明显升高，这提示我们prr可能影响循环系统的肾素活性，但prr尤其是sprr与肾素的相互调节机制是不清楚的。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供三种sprr-his对小鼠呋塞米饮水诱导的肾素活性影响的试验方法。为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：sprr-his对小鼠呋塞米饮水诱导的肾素活性影响的试验方法，包括下述步骤：步骤一，将正常的雄性小鼠随机分为三组，分别为对照组、模型组和给药组；步骤二，对三组小鼠进行相应的处理；对照组(ctr)，颈总静脉插管灌注含有sprr-his溶剂的植入式给药泵alzetosmoticpumps(alzet-1002,2weeks,0.25μl/hr)；模型组(furo)，颈总静脉插管灌注含有sprr-his溶剂的植入式给药泵alzetosmoticpumps(alzet-1002,2weeks,0.25μl/hr)，预处理3天，3天后给予1mg/ml的呋塞米溶液饮水一周；给药组(furo+sprr-his)，颈总静脉插管灌注含有浓度为45ug/kg/day的sprr-his的植入式给药泵alzetosmoticpumps(alzet-1002,2weeks,0.25μl/hr)，预处理3天，3天后给予1mg/ml的呋塞米溶液饮水一周；步骤三，一周后，将步骤二处理过的小鼠麻醉处死，提取血浆标本和肾脏皮质rna标本，检测血浆sprr、血浆总肾素水平、血浆基础状态angi、血浆肾素活性、血浆活化肾素含量和血浆总肾素含量。sprr-his对小鼠呋塞米饮水诱导的肾素活性影响的试验方法，包括下述步骤：步骤一，将正常的雄性小鼠随机分为五组，分别为对照组、模型组i、模型组ii、干预组i和干预组ii；步骤二，对五组小鼠进行相应的处理；对照组(ctr)，皮下包埋含有50％dmso+50％peg溶剂的植入式给药泵alzetosmoticpumps(alzet-1002,2weeks,0.25μl/hr)，同时颈总静脉插管灌注含有sprr-his溶剂的植入式给药泵alzetosmoticpumps(alzet-1002,2weeks,0.25μl/hr)；模型组ⅰ(0.25furo)，皮下包埋含有50％dmso+50％peg的植入式给药泵alzetosmoticpumps(alzet-1002,2weeks,0.25μl/hr)，同时颈总静脉插管灌注含有sprr-his溶剂的植入式给药泵alzetosmoticpumps(alzet-1002,2weeks,0.25μl/hr)，预处理3天，3天后给予0.25mg/ml的呋塞米溶液饮水一周；模型组ⅱ(0.5furo)，皮下包埋含有50％dmso+50％peg的植入式给药泵alzetosmoticpumps(alzet-1002,2weeks,0.25μl/hr)，同时颈总静脉插管灌注含有sprr-his溶剂的植入式给药泵alzetosmoticpumps(alzet-1002,2weeks,0.25μl/hr)，预处理3天，3天后给予0.5mg/ml的呋塞米溶液饮水一周；干预组ⅰ(0.25furo+pf)，皮下包埋含有溶度为25mg/kg/days1p抑制剂pf-429242(溶剂为50％dmso+50％peg)的植入式给药泵alzetosmoticpumps(alzet-1002,2weeks,0.25μl/hr)，同时颈总静脉插管灌注含有sprr-his溶剂的植入式给药泵alzetosmoticpumps(alzet-1002,2weeks,0.25μl/hr)，预处理3天，3天后给予0.25mg/ml的呋塞米溶液饮水一周；干预组ⅱ(0.5furo+pf)，皮下包埋含有溶度为25mg/kg/days1p抑制剂pf-429242(溶剂为50％dmso+50％peg)的植入式给药泵alzetosmoticpumps(alzet-1002,2weeks,0.25μl/hr)，同时颈总静脉插管灌注含有浓度为45μg/kg/day的sprr-his的植入式给药泵alzetosmoticpumps(alzet-1002,2weeks,0.25μl/hr)，预处理3天，3天后给予0.5mg/ml的呋塞米溶液饮水一周；步骤三，一周后，将步骤二处理过的小鼠麻醉处死，提取血浆标本和肾脏皮质rna标本，检测血浆sprr、皮质肾素mrna、血浆总肾素水平、血浆肾素活性和血浆活化肾素含量。sprr-his对小鼠呋塞米饮水诱导的肾素活性影响的试验方法，包括下述步骤：步骤一，将正常的雄性小鼠随机分为两组，分别为干预组i和干预组ii；步骤二，对两组小鼠进行相应的处理；干预组ⅰ(0.5furo+pf)，皮下包埋含有50％dmso+50％peg的植入式给药泵alzetosmoticpumps(alzet-1002,2weeks,0.25μl/hr)，同时颈总静脉插管灌注含有浓度为45μg/kg/day的sprr-his的植入式给药泵alzetosmoticpumps(alzet-1002,2weeks,0.25μl/hr)，预处理3天，3天后给予0.5mg/ml的呋塞米溶液饮水一周；干预组ⅱ(0.5furo+pf+sprr-his)，皮下包埋含有溶度为25mg/kg/days1p抑制剂pf-429242(溶剂为50％dmso+50％peg)的植入式给药泵alzetosmoticpumps(alzet-1002,2weeks,0.25μl/hr)，同时颈总静脉插管灌注含有sprr-his溶剂的植入式给药泵alzetosmoticpumps(alzet-1002,2weeks,0.25μl/hr)，预处理3天，3天后给予0.5mg/ml的呋塞米溶液饮水一周；步骤三，一周后，将步骤二处理过的小鼠麻醉处死，提取血浆标本和肾脏皮质rna标本，检测血浆肾素活性和血浆活化肾素含量。作为优选的技术方案，所述小鼠采用正常雄性c57bl/6j小鼠20～24g。由于采用了上述技术方案，sprr-his对小鼠呋塞米饮水诱导的肾素活性影响的试验方法，通过颈总静脉灌注sprr-his重组蛋白(45μg/kg/day)预处理c57bl/6j小鼠3天，然后用1mg/ml呋塞米饮水处理c57bl/6j小鼠处理1周，elisa法检测小鼠血浆中sprr含量，肾素活性；或者皮下埋泵给药pf-429242预处理c57bl/6j小鼠3天，然后用0.25mg/ml或0.5mg/ml呋塞米饮水处理c57bl/6j小鼠一周，elisa法检测小鼠血浆中renin/prorenin总含量、肾素活性和sprr，qrt-pcr方法检测小鼠肾脏皮质肾素mrna表达；或在用0.5mg/ml呋塞米饮水处理c57bl/6j小鼠同时给予皮下包埋pf-429242(30mg/kg/day)干预基础上，通过颈总静脉灌注sprr-his(45μg/kg/day)进行rescue试验，elisa法检测小鼠血浆肾素活性；通过小鼠呋塞米饮水试验构建肾素活化模型，通过试验结果明确sprr-his对血浆肾素分泌和肾素活性具有负反馈抑制作用。附图说明以下附图仅旨在于对本发明做示意性说明和解释，并不限定本发明的范围。其中：图1是本发明实施例第一种试验方法的血浆sprr柱状比较图；图2是本发明实施例第一种试验方法的血浆总肾素柱状比较图；图3是本发明实施例第一种试验方法的血浆基础状态angi柱状比较图；图4是本发明实施例第一种试验方法的血浆肾素活性柱状比较图；图5是本发明实施例第一种试验方法的血浆活化肾素含量柱状比较图；图6是本发明实施例第一种试验方法的血浆总肾素含量柱状比较图；图7是本发明实施例第二种试验方法的血浆sprr柱状比较图；图8是本发明实施例第二种试验方法的皮质肾素mrna水平柱状比较图；图9是本发明实施例第二种试验方法的血浆总肾素水平柱状比较图；图10是本发明实施例第二种试验方法的血浆肾素活性柱状比较图；图11是本发明实施例第二种试验方法的血浆活化肾素含量柱状比较图；图12是本发明实施例第三种试验方法的血浆肾素活性柱状比较图；图13是本发明实施例第三种试验方法的血浆活化肾素含量柱状比较图；图14是本发明实施例的实验流程图。具体实施方式下面结合附图和实施例，进一步阐述本发明。在下面的详细描述中，只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例。毋庸置疑，本领域的普通技术人员可以认识到，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，附图和描述在本质上是说明性的，而不是用于限制权利要求的保护范围。本发明采用正常雄性c57bl/6j小鼠20～24g作为试验素材，通过下述三个试验方法探究sprr-his对小鼠呋塞米饮水诱导的肾素活性的影响。第一种试验方法：sprr-his对小鼠呋塞米饮水诱导的肾素活性影响的试验方法，包括下述步骤：步骤一，将正常的雄性小鼠随机分为三组，分别为对照组、模型组和给药组；步骤二，对三组小鼠进行相应的处理；对照组(ctr)，颈总静脉插管灌注含有sprr-his溶剂的植入式给药泵alzetosmoticpumps(alzet-1002,2weeks,0.25μl/hr)；模型组(furo)，颈总静脉插管灌注含有sprr-his溶剂的植入式给药泵alzetosmoticpumps(alzet-1002,2weeks,0.25μl/hr)，预处理3天，3天后给予1mg/ml的呋塞米溶液饮水一周，如图14所示；给药组(furo+sprr-his)，颈总静脉插管灌注含有浓度为45μg/kg/day的sprr-his的植入式给药泵alzetosmoticpumps(alzet-1002,2weeks,0.25μl/hr)，预处理3天，3天后给予1mg/ml的呋塞米溶液饮水一周，如图14所示；步骤三，一周后，将步骤二处理过的小鼠麻醉处死，提取血浆标本和肾脏皮质rna标本，检测血浆sprr、血浆总肾素水平、血浆基础状态angi、血浆肾素活性、血浆活化肾素含量和血浆总肾素含量。alzetosmoticpumps是体积很小的渗透微泵，可植入实验动物皮下或腹腔内,直接或通过导管以μl/hr的速度持续准确地输注测试药剂。这种输注根据所使用的泵，可以在动物清醒无束缚条件下持续6个星期。alzet微渗透泵通过实验导管，可将物质输注到动静脉循环、脑部等任何器官腔内或固体组织内。下面的表一中展示了本试验方法的检测数据，数据为平均值±sem标准误。上述试验中的三个试验组，每个试验组6只动物。*p<0.05vs.ctr；#p<0.05vs.furo.所有数据均归一化到ctr。ctr是对照组，*代表与对照组相比，差异性均存在统计学意义(p值小于0.05)；#代表与furo组相比，差异性均存在统计学意义(p值小于0.05)。表一：与上述表一相对应，说明书附图的图1至图6中，通过柱状图展现了sprr-his对c57bl/6j小鼠动物呋塞米饮水诱导的血浆肾素表达，以及对肾素活性和血浆活性肾素含量的影响。结果分析：我们建立小鼠呋塞米饮水肾素活化模型，同时颈静脉灌注sprr-his重组蛋白，结果发现，如图1至图6所示，呋塞米可显著诱导血浆中sprr分泌增多，sprr-his灌注可进一步升高血浆sprr水平(如图1所示)，并且sprr-his灌注可显著抑制呋塞米诱导的血浆总肾素水平(如图2所示)、血浆基础状态angⅰ(如图3所示)、血浆肾素活性(如图4所示)、血浆活化肾素含量(如图5所示)和血浆总肾素含量(如图6所示)。在c57bl/6j小鼠中sprr-his灌注显著抑制呋塞米诱导的血浆肾素分泌和肾素含量的升高。第二种试验方法：sprr-his对小鼠呋塞米饮水诱导的肾素活性影响的试验方法，包括下述步骤：步骤一，将正常的雄性小鼠随机分为五组，分别为对照组、模型组i、模型组ii、干预组i和干预组ⅱ；步骤二，对五组小鼠进行相应的处理；对照组(ctr)，皮下包埋含有50％dmso+50％peg溶剂的植入式给药泵alzetosmoticpumps(alzet-1002,2weeks,0.25μl/hr)，同时颈总静脉插管灌注含有sprr-his溶剂的植入式给药泵alzetosmoticpumps(alzet-1002,2weeks,0.25μl/hr)；模型组ⅰ(0.25furo)，皮下包埋含有50％dmso+50％peg的植入式给药泵alzetosmoticpumps(alzet-1002,2weeks,0.25μl/hr)，同时颈总静脉插管灌注含有sprr-his溶剂的植入式给药泵alzetosmoticpumps(alzet-1002,2weeks,0.25μl/hr)，预处理3天，3天后给予0.25mg/ml的呋塞米溶液饮水一周，如图14所示；模型组ⅱ(0.5furo)，皮下包埋含有50％dmso+50％peg的植入式给药泵alzetosmoticpumps(alzet-1002,2weeks,0.25μl/hr)，同时颈总静脉插管灌注含有sprr-his溶剂的植入式给药泵alzetosmoticpumps(alzet-1002,2weeks,0.25μl/hr)，预处理3天，3天后给予0.5mg/ml的呋塞米溶液饮水一周，如图14所示；干预组ⅰ(0.25furo+pf)，皮下包埋含有溶度为25mg/kg/days1p抑制剂pf-429242(溶剂为50％dmso+50％peg)的植入式给药泵alzetosmoticpumps(alzet-1002,2weeks,0.25μl/hr)，同时颈总静脉插管灌注含有sprr-his溶剂的植入式给药泵alzetosmoticpumps(alzet-1002,2weeks,0.25μl/hr)，预处理3天，3天后给予0.25mg/ml的呋塞米溶液饮水一周，如图14所示；干预组ⅱ(0.5furo+pf)，皮下包埋含有溶度为25mg/kg/days1p抑制剂pf-429242(溶剂为50％dmso+50％peg)的植入式给药泵alzetosmoticpumps(alzet-1002,2weeks,0.25μl/hr)，同时颈总静脉插管灌注含有浓度为45μg/kg/day的sprr-his的植入式给药泵alzetosmoticpumps(alzet-1002,2weeks,0.25μl/hr)，预处理3天，3天后给予0.5mg/ml的呋塞米溶液饮水一周，如图14所示；步骤三，一周后，将步骤二处理过的小鼠麻醉处死，提取血浆标本和肾脏皮质rna标本，检测血浆sprr、皮质肾素mrna、血浆总肾素水平、血浆肾素活性和血浆活化肾素含量。下面的表二中展示了本试验方法的检测数据，数据为平均值±sem标准误。上述试验中的五个试验组，每个试验组6只动物。*p<0.05vs.ctr；#p<0.05vs.0.25furo；&p<0.05vs.0.5furo.所有数据均归一化到ctr。ctr是对照组，*代表与对照组相比，差异性均存在统计学意义(p值小于0.05)；#代表与0.25furo组相比，差异性均存在统计学意义(p值小于0.05)。&代表与0.5furo组相比，差异性均存在统计学意义(p值小于0.05)。表二与上述表二相对应，说明书附图的图7至图11中，通过柱状图展现了在c57bl/6j小鼠中s1p抑制剂pf-429242对由慢性呋塞米诱导的血浆肾素活性和肾脏肾素表达的影响。结果分析：我们利用s1p抑制剂pf-429242减少sprr分泌进而研究对于小鼠呋塞米饮水肾素活化模型中肾素表达、分泌和肾素活性的影响。结果发现，如图7至图11所示，pf-429242可显著抑制血浆中sprr分泌(如图7所示)，并可进一步上调不同浓度(0.25mg/ml，0.5mg/ml)呋塞米饮水所诱导的肾脏皮质肾素mrna水平(如图8所示)、血浆总肾素水平(如图9所示)、肾素活性(如图10所示)和活化肾素含量(如图11所示)。第三种试验方法：sprr-his对小鼠呋塞米饮水诱导的肾素活性影响的试验方法，包括下述步骤：步骤一，将正常的雄性小鼠随机分为两组，分别为干预组i和干预组ii；步骤二，对两组小鼠进行相应的处理；干预组ⅰ(0.5furo+pf)：皮下包埋含有50％dmso+50％peg的植入式给药泵alzetosmoticpumps(alzet-1002,2weeks,0.25μl/hr)，同时颈总静脉插管灌注含有浓度为45μg/kg/day的sprr-his的植入式给药泵alzetosmoticpumps(alzet-1002,2weeks,0.25μl/hr)，预处理3天，3天后给予0.5mg/ml的呋塞米溶液饮水一周，如图14所示；干预组ⅱ(0.5furo+pf+sprr-his)：皮下包埋含有溶度为25mg/kg/days1p抑制剂pf-429242(溶剂为50％dmso+50％peg)的植入式给药泵alzetosmoticpumps(alzet-1002,2weeks,0.25μl/hr)，同时颈总静脉插管灌注含有sprr-his溶剂的植入式给药泵alzetosmoticpumps(alzet-1002,2weeks,0.25μl/hr)，预处理3天，3天后给予0.5mg/ml的呋塞米溶液饮水一周，如图14所示；步骤三，一周后，将步骤二处理过的小鼠麻醉处死，提取血浆标本和肾脏皮质rna标本，检测血浆肾素活性和血浆活化肾素含量。与肾素系统有关的呋塞米的主要副作用是：如果盐和水的缺失长期没有得到补偿，则诱导严重的盐耗竭和细胞外容量收缩。为了避免试验中的细胞外容量收缩，在食物中添加盐粒，允许动物自由获取，在呋塞米饮水过程中保持正常的钠平衡。下面的表三中展示了本试验方法的检测数据，数据为平均值±sem标准误。上述试验中的两个试验组，每个试验组6只动物。βp<0.05vs.0.5furo+pf。β代表与0.5furo+pf组相比，差异性均存在统计学意义(p值小于0.05)。所有数据均归一化到0.5furo+pf。表三组名血浆肾素活性血浆活化肾素含量0.5furo+pf1.00±0.081.00±0.140.5furo+pf+sprr-his0.46±0.10*0.12±0.01*比较了呋塞米饮水模型同时给予pf-429242处理的c57bl/6j的两组小鼠，在此基础上，一组颈总静脉灌注sprr-his，另一部灌注sprr-his溶剂作为对照组，观察sprr-his对于肾素活性和活化肾素含量的影响，结果发现，sprr-his对pf429242所诱导的呋塞米肾素活化模型的进一步活化具有逆转作用，与对照组相比，sprr-his灌注可显著抑制肾素活性和肾素活化水平(如图12和图13所示)。在呋塞米诱导的肾素活化小鼠模型中，发现血浆中sprr的分泌显著增多，而外源性灌注sprr-his重组蛋白可显著抑制肾素活化和肾素分泌，通过s1p抑制剂pf-429242减少内源性sprr可进一步诱导肾素活化和肾素分泌。综上所述，sprr在体内可负反馈抑制血浆肾素的分泌和肾素活性。肾素是参与高血压调节的激素之一。如何减少肾素分泌是目前高血压药物治疗的研究热点。本技术方案采用多种试验方法探究sprr调节肾素分泌的机制，提出负反馈调节抑制肾素分泌，具有创新性，对肾素分泌的机制进行了探讨和补充(负反馈机制)，对高血压的防治具有一定的临床意义，并揭示其在肾脏病理生理学中有一定的潜在影响。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。当前第1页1 2 3 

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