一种耐盐性水稻品种的筛选方法与流程

本发明涉及一种水稻的筛选方法，尤其涉及一种耐盐性水稻品种的筛选方法，属于农业技术领域。

背景技术：

为了缓解人口增长带来的粮食压力，每年需要将作物生产力提高约4400万吨。然而，由于有限的耕地面积，不稳定的环境条件以及与气候变化紧密相关的非生物胁迫的发生，作物产量的提高变得非常具有挑战性。在非生物胁迫源中，干旱和盐碱化严重阻碍了世界上作物的生产。全球范围内，有100多个国家或地区有大约10至100亿公顷的土地受盐害影响，占土地总面积的7％-10％以上，并且有可能以每年10％-15％的速度增长。在亚洲，有550万公顷的水稻种植区受到土壤盐碱性的影响。在南亚和东南亚由于土壤盐碱化，未耕种的农业面积为4800万公顷。在我国盐碱地面积大、分布广、种类多，随着社会经济发展和城市化建设进程的加快，土地短缺的矛盾日益加重，稳定粮食种植面积的压力越来越大，开发利用好沿海滩涂等盐渍化土壤是增加耕地的有效途径。

水稻作为改良盐土的先锋作物，鉴定和筛选出其耐盐品种至关重要。目前，国内外用于鉴定和评价耐盐水稻的方法大体分为两种，即生物耐盐能力指标法和农业耐盐能力指标法。水稻生物耐盐能力指标法是指通过水稻植株的生长量、株高、根长等指标评价水稻在耐盐环境中的生存能力，它以盐胁迫对植株造成的直接伤害为依据评价水稻品种的耐盐性。主要包括发芽指数法、生长量比较法和形态伤害评价法等，其中，形态伤害评价包括两种调查方法，一种是国际水稻研究所提出的盐害症状目测法分级标准及平均死叶百分比分级标准，另一种是我国规定的水稻单茎(株)分级法耐盐鉴定标准。农业耐盐能力反映了水稻在盐胁迫环境下的产量等生产力状况，主要方法是成熟期以分蘖为单位调查有效穗数、结实率、产量等指标来评价耐盐性。

而关于水稻耐盐性生理指标上，国内外也有了比较充足的研究。植株通过增加细胞中的溶质来进行渗透调节，渗透调节是植物适应盐分胁迫的主要机制之一。参与渗透调节的无机离子包括na+、k+和cl-；不同作物对离子的选择性不同，有些作物选择na+排斥k+，而有些作物则相反。此外，植物自身会合成和积累一些有机小分子物质来进行渗透调节，如脯氨酸、甜菜碱、多胺、可溶性糖等，可以作为渗透调节剂，也可以作为阴离子与na+、k+等进行螯合，以平衡过量的盐分。植物体内可溶性糖含量越多，其抗逆性就越强。在盐碱逆境中，植物细胞膨压是靠可溶性糖这个渗透调节物质来维持，同时可溶性糖也是逆境胁迫的适应物质。王伟华、肖强等认为盐碱胁迫导致植物体内可溶性糖含量上升。高显颖研究发现拔节期，随着盐碱胁迫的增强，可溶性糖含量在逐渐升高。张瑞珍发现种植在盐碱地上的水稻秧苗脯氨酸和可溶性糖含量都明显增加，但可溶性糖含量增加的幅度较脯氨酸含量增加幅度小，从二者的绝对含量来说，脯氨酸含量也较高，比可溶性糖含量高出好几个数量级，说明脯氨酸是逆境下植物体内有效的渗透调节剂之一，对渗透调节所起的作用也较大。以上生理指标均能够反映出水稻植株的耐盐能力，但总体上表现出三方面的不足：一是以上耐盐性指标测量时样本量较少，整个过程很难保证选取的样品都具有代表性，同时会产生较大的误差。二是这些耐盐性指标包括产量、结实率、渗透调节物质等测定周期长，工作量大。三是未将水稻盐胁迫下最敏感的光合蒸腾生理变化纳入评价体系，水稻耐盐性与植株光合水分光合蒸腾损失紧密相连，光合蒸腾是植株水分损失的主要途径，影响冠层温度与植株耐盐性。

技术实现要素：

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种对水稻无损，准确度高、快速、可大规模筛选耐盐性水稻品种的方法。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供一种水稻耐盐性品种的筛选方法，是在水稻特定生长时期，在不同盐分浓度胁迫处理下分别拍摄水稻冠层照片，根据水稻冠层照片测定和计算出在不同盐分浓度胁迫处理下水稻冠层温度变化与盐分梯梯度胁迫的斜率k值作为筛选耐盐性水稻的评价指标，当k≥25为盐敏感性水稻品种，当k＜25为耐盐性水稻品种。

其中，所述特定生长时期为水稻开花期。

其中，所述不同盐分浓度胁迫处理包括盐空白处理，0.1％盐处理，0.2％盐处理和0.3％盐处理。

其中，所述拍摄水稻冠层照片的时间在开花期的晴好天气的中午12:00。

其中，所述拍摄水稻冠层照片使用的是短波红外线扫描相机

其中，所述拍摄水稻冠层照片时的水稻样品为从不同土壤盐分浓度势梯度处理的田间选取长势均一，能代表当前处理生长状态的连续两行水稻。

其中，所述测定和计算出水稻冠层温度可采用flirtools软件。

其中，所述测定和计算不同盐分浓度处理下的水稻冠层温度随土壤盐分浓度变化斜率k值可在excel软件中通过直线拟合求得。

水稻常作为盐土改良的“先锋”作物，利用其一定的耐盐碱性独特优势，能够加快盐土的改良与有机质的积累，实现既利用土壤，又改良土壤，把改良寓于利用之中，利用又促进改良，越种越适宜种稻，形成改良与利用相互促进的循环。所以种植水稻有具有集“用、改、养”三位一体持续加速优化改良盐碱地的特殊作用。但在盐碱地水稻栽培中盐分这一限制因素十分重要，大大降低了水稻产量和品质。因此，了解和掌握盐胁迫对水稻生长、生理生化等的影响对于提高盐碱地水稻综合生产能力、保障国家粮食安全具有十分重要的意义。水稻冠层温度是水稻生理生态特征之一，冠层温度的变化与盐分胁迫密切相关。研究冠层温度对于水稻耐盐性及对相关生理生化指标的影响具有重要意义。

本发明方法中包括三个要点：一是不同盐分浓度梯度胁迫的确定；二是水稻冠层温度的获取及分析；三是耐盐水性稻品种生理生态指标的确定。该指标将水稻冠层温度等生理生态指标纳入评价体系，既能反映一个水稻品种对于盐分浓度梯度胁迫的响应及盐分浓度梯度胁迫对于水稻植株生理生态变化影响及二者之间的相关性，又能用于耐盐性水稻品种的筛选。

在水稻特定的生长时期使用短波红外线扫描相机拍摄水稻冠层照片，同时使用相关配套软件计算不同盐分胁迫处理下的水稻冠层温度tcanopy和中午十二点时冠层温度变化与盐分浓度梯度胁迫的斜率k值，以k值作为筛选耐盐性水稻品种的评价指标。其k值越大表明冠层温度上升速率越快，代表水稻品种的耐盐性越低，k值越小表明冠层温度上升速率越慢，代表水稻品种的耐盐性越高。

有益效果：相对于现有技术，本发明具有以下优势：

(1)可用于辅助耐盐水稻品种的筛选，可用于大规模种质筛选，表型组学研究。测量时间短，准确度高。例如分析100个基因型，拍照测量所用时间仅为十分钟，随后就可进行数据分析，高效便捷的辅助耐盐水稻的品种筛选，且对水稻无损伤。

(2)可全生育期监控，分析不同时期耐盐性机理，可用于测定各个生育时期内水稻植株的耐盐性的评价分析。例如，增加测定时期，即可分析整个生育期内水稻冠层的温度变化及其与盐分浓度梯度胁迫的相互关系；分析该生育周期内水稻植株冠层温度变化动态规律与产量的相关性。

(3)可用于水稻耐盐性的评价指标。盐分浓度梯度胁迫对于不同类型水稻植株冠层温度及其与植株高产耐盐具有一定的相关性。分析植株冠层温度与相关耐盐生理指标变化规律和与盐分浓度梯度胁迫的关系，为水稻耐盐栽培提供指导。k值的大小与水稻耐盐性、耐盐相关生理生化指标及最终产量密切相关，为新品种水稻筛选提供依据。

附图说明

图1为开花期水稻热力学红外照片；

图2为各品种不同盐分处理下开花期冠层温度变化拟合直线；

图3为各品种盐分处理下开花期水稻剑叶光合值；

图4为各品种盐分处理下开花期水稻剑叶酶活性和小分子物质含量。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1耐盐性水稻的筛选方法的建立

1.试验地概况和供试品种

试验于2018年和2019年在扬州大学江苏省作物栽培生理重点实验室土培池进行。前茬作物均为小麦。土壤质地为沙壤土，含有机质24.4g/kg、碱解氮105mg/kg、速效磷34.3mg/kg、速效钾68.2mg/kg；参试材料共6个，均为江苏省近年来各阶段在生产上广泛应用的具有不同耐盐代表性的水稻品种：连鉴5号，连鉴6号，连鉴7号，南粳9108，南粳5055，南粳46。人工模拟机插秧栽培设置育苗、移栽与栽插方案，5月18日浸种，5月23日播种，5月25日移至秧板，6月13日移栽，每穴2苗。

2.处理设置

试验采用裂区试验设计，以盐分浓度梯度为主区，品种为裂区，三次重复。各主区处理根据土壤体积、密度及土壤含盐量计算出各土培池应施的海盐质量，移栽前将对应质量的q/zyl型速溶海水晶(浙江蓝海星盐制品厂生产，按天然海水成分研制，基本保留了海水的主要成分)均匀撒施在各个土培池中，并与土壤搅拌均匀。

(1)盐空白处理：总施氮量(纯氮)为300kg/hm2，按基肥(移栽前):分蘖肥(移栽后5-7天):促花肥(叶龄余数3.5):保花肥(叶龄余数1.2)＝5:2:2:1，栽插株行距为13.3cm×30cm。施磷量(过磷酸钙，含p2o513.5％)90kg/hm2，于移栽前作基肥一次性施入。施钾量(氯化钾，含k2o63％)120kg/hm2，分基肥和拔节肥(促花肥)两次使用，前后两次的比例为6:4。除生育中期排水搁田外，其余时期保持水层至收获前一周断水。

(2)0.1％盐处理：于移栽前将对应质量的海水晶均匀撒施在各个土培池中，并与土壤搅拌均匀，用fp640火焰分光光度计测量土壤中的盐分含量，确定土壤含盐量为0.1％，并在水稻生长过程中用土壤盐分仪随时监测土壤含盐量并及时补充盐分。其余栽培措施包括肥料使用、灌溉措施等与盐空白栽培方式相同。

(3)0.2％盐处理：于移栽前将对应对应质量的海水晶均匀撒施在各个土培池中，并与土壤搅拌均匀，用fp640火焰分光光度计测量土壤中的盐分含量，确定土壤含盐量为0.2％，并在水稻生长过程中用土壤盐分仪随时监测土壤含盐量并及时补充盐分。其余栽培措施包括肥料使用、灌溉措施等与盐空白栽培方式相同。

(4)0.3％盐处理：于移栽前将对应对应质量的海水晶均匀撒施在各个土培池中，并与土壤搅拌均匀，用fp640火焰分光光度计测量土壤中的盐分含量，确定土壤含盐量为0.3％，并在水稻生长过程中用土壤盐分仪随时监测土壤含盐量并及时补充盐分。其余栽培措施包括肥料使用、灌溉措施等与盐空白栽培方式相同。

3.水稻耐盐性的定量分析

1)于水稻开花期使用短波红外线扫描相机从田间选取长势均一，能代表当前处理生长状态的连续两行水稻，测量时期及时间控制在开花期晴好天气的中午12:00，拍照测量结束后，根据热力学照片，使用flirtools软件分析红外照片，测定和计算不同盐分浓度胁迫处理下的水稻冠层温度tcanopy。

2)通过红外成像照片分析获得水稻冠层温度tcanopy及其随着盐分浓度梯度胁迫的斜率k值，通过拟合土壤水势与冠层温度可以在excel软件中求得k值。其中选取的4个温度点分别代表同一品种在盐空白，0.1％盐分处理，0.2％盐分处理，0.3％盐分处理下的冠层温度。k值越大表明水稻冠层温度上升幅度越大，代表水稻品种的耐盐性越弱；k值越小表明水稻冠层温度上升幅度越小，代表水稻品种的耐盐性越强。

4.水稻相关耐盐性指标的测定及验证方案的可行性

主要包括开花期水稻各品种盐分处理下开花期水稻根、茎、叶中na+、k+含量及比值；开花期剑叶的光合值；开花期各品种盐分处理下开花期水稻剑叶酶活性和小分子物质含量。

数据测定与整理的方法为：

na+、k+含量及比值的测定：各小区分别取开花期根、茎、叶、穗干样，粉碎后称取0.25g，加5ml浓度为95％的h2so4，微波消解后定容至25ml，用fp640火焰光度计测定na+、k+含量并计算比值。

光合值的测定：于水稻开花期，用li-6400便携式光合仪测定水稻主茎剑叶的净光合速率(pn)。各小区重复5次，于上午9:00-11:00测定，测定时光量子密度为1500μmol/m2s，空气中co2浓度为380μmol/mol左右。

剑叶酶活性和小分子物质含量的测定：于水稻开花期，各小区分别取5张剑叶测定相关生理指标：超氧化物歧化酶(sod)采用氮蓝四唑光还原法测定，反应产物h2o2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(nbt)在光下的还原作用来确定酶活性的大小在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易被氧化而产生超氧阴离子，超氧阴离子可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而sod可清除超氧阴离子，从而抑制了甲腙的形成于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶的活性愈低，反之酶的活性愈高据此可计算出酶活性的大小酶活性单位为(u/gfw)。过氧化物酶(pod)采用愈创木酚法测定其活性，氧化物酶催化h2o2氧化酚类，生成醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的产物本实验以愈创木酚为底物，过氧化物酶催化h2o2将愈创木酚氧化生成茶褐色产物，此产物在470nm波长处有最大吸收峰，故可通过测定470nm波长下的吸光度变化得知过氧化物酶的活性以(u/gfw)为单位。丙二醛(mda)含量采用硫代巴比妥酸(tba)法测定，丙二醛在高温及酸性环境下可与2-硫代巴比妥酸(tba)反应产生红棕色的产物3，5，5-三甲基恶唑2，4-二酮(三甲川)，该物质在532nm处有一吸收高峰，并且在660nm处有较小光吸收根据其532nm的消光值可计算出溶液中丙二醛的含量。醛，可溶性糖对此反应有干扰，在450nm处有一吸收峰，可用双组分分光光度法加以排除，单位为(μg/gfw)。脯氨酸(pro)含量采用试剂盒测定，用磺基水杨酸(sa)提取pro，加热处理后，pro与酸性茚三酮溶液反应生成红色；加甲苯萃取后，在520nm测定吸光度，单位为(μg/gfw)。

5.效果

各水稻品种在不同盐分浓度处理下的产量及构成因素见表1。

表1各水稻品种不同盐分浓度处理下的产量及其构成因素

由表1可知在盐空白处理下，南粳9108、南粳5055和南粳46的产量高于连鉴5号、连鉴6号和连鉴7号。经过盐分处理后各个水稻品种的产量均显著下降，但是连鉴5号、连鉴6号和连鉴7号产量显著高于南粳9108、南粳5055和南粳46。所有水稻品种产量下降主要原因是盐分的施用使得穗数、每穗粒数、结实率和千粒重的显著下降。但是，南粳9108、南粳5055和南粳46与连鉴5号、连鉴6号和连鉴7号相比，穗数、每穗粒数、结实率和千粒重下降幅度显著增大，导致产量显著下降。

各水稻品种不同盐分浓度处理下冠层红外照片，开花期冠层温度，开花期冠层温度变化拟合直线分别见图1，表2，图2。

表2各水稻品种不同盐分浓度处理下开花期冠层温度

由图1可知，使用短波红外线扫描相机能够清楚的显示，与不施盐处理相比，盐分的处理使得照片冠层部分红色区域面积变大，颜色变深，表明冠层温度显著上升。南粳9108、南粳5055和南粳46与连鉴5号、连鉴6号、连鉴7号相比，在不施盐处理下的热力学照片中红色高温部分差异不明显。随着施盐量的上升南粳9108、南粳5055和南粳46较与鉴5号、连鉴6号、连鉴7号相比，红色面积显著增加，颜色显著上升，温度上升幅度显著提高。

由表2和图2可知，在盐空白处理下各水稻品种的冠层温度均在28℃左右，差异不显著，随着施盐量上升，南粳9108、南粳5055和南粳46的温度显著上升，冠层温度变化率(k)值均超过25，与连鉴5号、连鉴6号和连鉴7号相比显著提高，证明连鉴5号、连鉴6号、连鉴7号为耐盐水稻品种，南粳9108、南粳5055和南粳46为盐敏感水稻品种。

各水稻品种盐分处理下开花期水稻根、茎、叶中na+、k+含量及比值见表3。

表3各水稻品种盐分处理下开花期水稻根、茎、叶中na+、k+含量及比值

由表3可知，各水稻品种根、茎、叶、穗中的na+、k+含量均有不同。随着施盐量的上升，各个部位中的na+含量显著上升、k+含量显著下降，k+/na+比值显著下降。南粳9108、南粳5055和南粳46与连鉴5号、连鉴6号、连鉴7号相比，na+含量和na+/k+比值显著增加，k+含量显著下降。盐胁迫下，水稻体内积累大量的na+等有毒离子，打破植株体内离子平衡，并且导致水分失衡，最终对水稻的生长发育造成影响。为维持正常的生理代谢功能，植物体常通过根系的选择性吸收来抑制na+进入，促进na+的外排及区隔化，维持较高的k+/na+比值，降低盐害影响。以上结果证明，连鉴5号、连鉴6号、连鉴7号为耐盐水稻品种，南粳9108、南粳5055和南粳46为盐敏感水稻品种。

由图3可知，各水稻品种在盐分浓度梯度胁迫下剑叶光合值均显著下降，在盐空白处理下各水稻品种的光合值差异不显著。而随着施盐量的上升，连鉴5号、连鉴6号、连鉴7号剑叶的光合值显著高于南粳9108、南粳5055和南粳46剑叶的光合值，结果表明在高盐分处理下，连鉴5号、连鉴6号、连鉴7剑叶仍能保持较高的光合值以维持光合作用。证明连鉴5号、连鉴6号、连鉴7号为耐盐水稻品种，南粳9108、南粳5055和南粳46为盐敏感水稻品种。

由图4可知，在抗逆性酶活性上在开花期各个水稻品种均在0.2％盐分处理下的sod活性值达到最大，且在0.3％盐分处理下显著下降，同时连鉴5号、连鉴6号、连鉴7号的sod活性显著大于南粳9108、南粳5055和南粳46。在开花期各个水稻品种的pod活性与sod规律一致。在小分子物质上与不施盐处理相比盐分胁迫显著增加了各个水稻品种的脯氨酸(pro)含量且随着盐分浓度的增加pro含量也呈现上升的趋势。连鉴5号、连鉴6号、连鉴7号与南粳9108、南粳5055和南粳46相比，pro在开花期的积累量显著提高，表明连鉴5号、连鉴6号、连鉴7号可以积累更多的pro于植株体内以增加植株的耐盐性。连鉴5号、连鉴6号、连鉴7号的丙二醛(mda)含量显著低于南粳9108、南粳5055和南粳46，随着盐分浓度梯度的提高，连鉴5号、连鉴6号、连鉴7号于0.2％盐浓度时达到最低值，而南粳9108、南粳5055和南粳46在0.1％盐浓度时达到最低值随后显著上升，表明连鉴5号，连鉴6号，连鉴7号具有较强的抗盐特性原因是植株体内可以减少脂质氧化水平，减少mda的积累量。以上结果证明，连鉴5号、连鉴6号、连鉴7号为耐盐水稻品种，南粳9108、南粳5055和南粳46为盐敏感水稻品种。

实施例2耐盐性水稻的筛选方法准确度验证

为了验证实施例1的耐盐性水稻的筛选方法的准确性，对市场上常见的耐盐性水稻品种与盐敏感水稻品种进行验证，水稻品种包括盐丰47、盐粳44、宁粳44、宁粳45、淮稻5、扬稻6、武运粳30、连粳7，参照实施例1所述的方法测量其k值，具体数据见表4。

表4k值法筛选耐盐水稻准确性的验证

由表4可知，盐敏感性水稻品种的k值均大于25，耐盐性水稻品种的k值均小于25，由此说明所述的筛选耐盐性水稻品种的方法准确性为100％。

综上所述，本发明提出的冠层温度变化与盐分浓度梯度胁迫的斜率k值，其k值越大表明冠层温度上升速率越块，代表水稻品种的耐盐性越弱，k值越小表明冠层温度上升速率越慢，代表水稻品种的耐盐性越强，其中，当k≥25为盐敏感性水稻品种，当k＜25为耐盐性水稻品种。冠层温度变化与盐分浓度梯度胁迫的斜率k值能够准确表征盐空白，0.1％盐处理，0.2％盐处理，0.3％盐处理下水稻的耐盐性指标及变化，具有普遍性及准确性。

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