水稻分子导航育种方法及应用与流程

本发明涉及生物领域，尤其涉及分子育种和基因工程领域。

背景技术：

水稻是重要的粮食作物，是我国一半人口的主粮。我国人口持续增长、对优质稻米需求不断增加，提高水稻品种的产量和品质具有十分重要的意义。目前，水稻育种还主要依赖经验育种，水稻品种培育的周期一般为5-8年，时间较长。

随着水稻功能基因组学和基因组学的快速发展，越来越多的水稻数量性状位点和基因被发掘和克隆。例如，研究发现高产水稻品种“habataki”中gn1a基因编码区的错义突变造成其每穗粒数较常规水稻品种增加，从而提高水稻产量；在高抗稻瘟病材料“谷梅4号”中克隆得到pigm基因，该基因可显著提高不含pigm抗病等位的水稻材料的稻瘟病抗性。针对这些数量性状基因的优异等位开发与其高度连锁的分子标记，进行分子标记对杂交后代进行筛选，可以快速准确的找到携带目标基因型的育种后代材料，提高水稻育种效率。虽然已有几百个控制产量、品质、抗性等重要农艺性状的水稻数量性状基因被克隆，但是仅有waxy、dep1、badh2、xa5等少数基因被应用于分子辅助选择育种，大量优异等位基因还没有被应用于分子育种。此外，现有的分子辅助选择技术大多依赖的是与优异等位基因紧密连锁的分子标记进行筛选，而不是针对数量性状位点的关键变异进行筛选，有一定的错误率。大多数已克隆的水稻数量性状基因的关键变异位点被发掘，但是相关的基因和关键变异位点信息缺乏有效整合和利用，亟需建立水稻数量性状位点的变异图谱，使水稻数量性状位点信息可以准确高效的应用于分子育种中，提高材料筛选的准确性和效率。

另一方面，传统水稻育种的周期较长、群体规模较大，使得水稻育种成本居高不下。全基因组重测序技术已应用于水稻数量性状位点定位和克隆研究中，极大地提高了水稻数量性状基因分子克隆的速度。利用该技术对水稻育种群体进行筛选，可以快速精准判断每个材料的基因型，提高材料选择的准确性。同时，水稻高密度遗传连锁图谱已经建立，通过基准测试模拟可以评估导入的优异等位的数量、群体大小、选择的目标材料数、选择的染色体片段的大小、导入基因在染色体的位置等各种参数对选择效果的影响。因此，建立基于全基因组重测序的分子导航系统可以根据需要导入的基因，合理确定水稻育种改良的周期和群体规模，减少水稻培育周期，提高育种效率。

本发明拟开发水稻分子导航育种技术，整合已克隆的水稻数量性状基因信息，建立水稻育种路线预测系统，根据用户需求，即导入的优异等位的数量和基因位置等信息，给出合理的水稻育种群体、周期和材料选择建议，帮助用户实现快速精准的水稻分子育种，降低水稻育种成本、提高水稻育种效率。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种能够指导水稻分子育种的方法。经过大量研究，本发明提出来一种基于高通量测序，依据完整的水稻数量性状关键变异位点图谱和水稻分子育种生物信息模拟的结果，预测最佳分子育种路线图的方法进行水稻分子育种，培育高产优质高抗的水稻新品种，提高水稻育种效率、降低育种成本。

本申请的发明人在进行了大量模拟后发现，对单个水稻数量性状位点而言，对其被筛选到的概率影响较大的参数主要有：回交群体规模、回交的世代数量、拟导入的染色体片段长度、杂合的染色体片段占基因组比例等。其中关键参数为：回交的群体大小、回交的世代数量、选择片段大小。

具体而言，本发明提供一种水稻分子导航育种方法，其特征在于，所

述方法包括下述步骤：

步骤1：收集水稻数量性状基因功能变异位点信息，将所述数量性状基因功能变异位点的序列和位置信息还原到参考基因组上，去除连锁及冗余位点，构建水稻数量性状基因关键功能变异位点图谱，所述图谱中包含所收集的各个变异位点以及相应变异的功能变化；

步骤2：利用生物信息模拟在水稻杂交和回交过程中单个水稻数量性状位点被选择概率，评估各个参数对筛选概率的影响，进而确定在分子导航育种模拟中的关键参数及其对后代材料选择效率的影响；

步骤3：将所述关键参数代入到分子导航育种模拟中，分析用户提供的受体亲本的测序数据或基因型数据以及目标位点数据，模拟所述受体亲本与各个供体材料杂交后的子代基因型，筛选出目标数量性状位点全部导入且纯合的材料，进而确定分子育种的路线图和最佳目标材料。

另一方面，本发明提供上述法的应用，所述应用包括下述之一：

(1)为水稻分子育种选择受体亲本需要进行遗传改良的目标基因；

(2)为水稻分子育种选择适合的供体亲本；

(3)为水稻分子育种选择适合的群体规模和回交次数；以及

(4)为水稻分子育种选择适合的后代材料，

所述的水稻品种包括常规稻、杂交稻恢复系、杂交稻保持系和杂交稻不育系。

在本发明方法提出之前，水稻分子育种所需的时间较长、成本较高，缺乏数量性状关键功能变异位点图谱和基于二代测序的快速育种方法。

本方法适用于水稻分子育种。通过水稻分子导航育种软件预测，可以给出经济合理的分子育种路线，结合低覆盖的基因组测序，所需的成本低、导入片段小、效率高。

技术效果

本发明方法具有育种代数少、成本低、导入片段小的优势。通过与已发表的水稻分子育种工作相比，本发明方法导入相同数量的目标基因时所需的代数少于现有方法、导入片段较现有方法小。

关于成本，本发明方法将回交群体中的株系进行低覆盖测序，而且群体规模控制在适中水平，有效降低了成本。

优选地，本发明方法可以应用于各种有参考基因组序列的自交作物或异交作物自交系的分子育种。

附图说明

图1为水稻数量性状基因功能变异位点在水稻基因组上的分布；

图2为影响水稻分子育种的因素及基准化分析；

图3为水稻分子导航育种技术的开发过程；

图4为利用分子导航育种技术发掘水稻自然群体中的优异供体资源；

图5为利用水稻分子导航育种技术实现水稻品种“黄华占”的改良过程。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明方法适用于水稻常规种、三系不育系、三系恢复系、三系保持系、两系不育系、两系恢复系的分子育种。

实施例1水稻数量性状基因关键功能变异位点图谱的构建

本实施例中，将对利用水稻数量性状基因关键功能变异位点图谱的构建进行描述。概括来讲，首先收集水稻数量性状基因功能变异位点信息，将所述数量性状基因功能变异位点的序列和位置信息还原到参考基因组上，然后去除连锁及冗余位点，构建水稻数量性状基因关键功能变异位点图谱。

具体而言，水稻数量性状基因关键功能变异位点图谱通过下述步骤实现：

步骤1.1、水稻数量性状基因变异位点的收集

具体而言，利用高级检索式ti＝(riceororyza)andts＝(qtlorqtlsorgeneoralleleorhaplotypeorvariationormappingorgwas)从webofscience数据库中检索水稻数量性状基因相关的文献，从文献中发掘已克隆的水稻数量性状位点基因。去掉其中无自然变异的基因、非洲栽培稻基因、尚未进行功能验证的基因，保留已在育成品种中利用的野生稻抗病抗虫基因，得到有自然变异的水稻数量性状基因225个，获得变异位点786个。根据日本晴基因组序列(msuv7.0版)，将发掘的水稻数量性状基因的变异位点在基因上的位置转化为日本晴基因组上的位置。

步骤1.2、利用水稻自然群体基因组序列筛选关键功能变异位点

对来自28个国家的404份具有代表性的水稻自然群体材料进行全基因组重测序(测序深度为覆盖基因组10到20倍)，以日本晴基因组(msuv7.0)作为参考序列，利用bwa0.7、samtools1.5、gatk3.0和gatk4.0等软件获得大量单核苷酸多态性和插入缺失位点。将步骤1中获得的变异位点与自然群体中的单核苷酸多态性位点及插入缺失位点进行比对，获得在水稻自然群体中可以被检测到的位点523个。进一步根据变异位点在自然群体的基因型，计算变异位点相关系数，去除高度连锁(r>0.9)的冗余变异位点276个，保留能最大程度代表变异等位基因的关键功能变异位点337个，其中易于检测的snp(单核苷酸多态性)位点和indel(插入缺失)位点247个。

步骤1.3、发掘新的水稻数量性状基因关键功能变异位点

发掘自然群体变异位点中发生在数量性状基因上的功能丧失型的变异，与步骤2获得的关键功能变异位点进行比对，发掘新的功能丧失型的变异。将发掘的功能丧失型位点与该基因上的已发掘的关键功能变异位点进行连锁分析，剔除与已发掘关键功能变异位点高度连锁的功能丧失型位点，将剩余的20个功能丧失型位点与步骤2获得的位点合并，形成完整的水稻数量性状基因关键功能变异位点图谱，包含267个水稻数量性状基因关键功能变异位点。这些水稻数量性状基因的关键变异位点均匀分布在水稻的12条染色体上(图1)。

实施例2水稻分子导航育种程序开发

本实施例中，将对水稻分子导航育种方法的实施过程进行详细描述。

步骤2.1、利用计算机语言编写水稻分子导航育种的关键功能变异位点选择模块，该模块可以通过调用业界标准分析工具(bowtie2,samtools,gatk)，将拟改良品种的二代测序的基因组序列比对到水稻参考基因组序列上，过滤pcr实验过程中可能产生的序列重复，并对联配到插入缺失位点周围的序列进行重新联配，最终将个体读序的联配信息存储于二进制文件种。基于实施例1构建的水稻数量性状基因关键功能变异位点的图谱信息，利用多种方法对二进制文件中的数量性状变异位点进行基因分型：(a)对snp类型的变异采用gatk3和gatk4软件分型；(b)对大的结构变异利用manta鉴定；(c)对整段基因缺失类型利用sambamba判断覆盖深度从而判断基因型；(d)对于水稻参考基因组缺失的大的变异片段，收集变异序列数据集合作为新的参考序列，将无法联配到日本晴参考基因组的读序联配到新的参考序列上评估覆盖率来确定基因型。获得关键功能变异位点的标准化基因型以及每个变异位点的功能信息，发掘基因型是不利等位的基因位点。获得用户水稻材料在已知水稻重要数量性状变异位点qtn的标准化基因型以及每个变异位点的功能信息。用户可基于该信息获知水稻材料在哪些水稻性状上有待改善。用户根据育种目的，选择待改善的1-4个关键功能变异位点在水稻自然群体材料基因型矩阵中进行搜索，获得基因位点是有利等位的水稻材料作为候选的供体材料。

步骤2.2、基于高密度水稻遗传连锁图谱(huangetal.,genomeresearch,2009,19:1068-1076)，根据遗传连锁和交换原理，利用计算机语言开发分子导航育种程序的后代基因型模拟模块，利用该模块可模拟出两个水稻杂交后代bcnf1群体所有的后代基因型。

步骤2.3、利用计算机语言开发水稻分子导航育种程序的材料选择模块，该模块通过对回交群体基因组区块(如0.3mb)的基因型矩阵数据进行统计，判断该群体中每个个体的基因组信息，包括(a)杂合片段覆盖的基因个数、(b)重组断点数量、(c)杂合片段数量、(d)全基因组杂合率、(e)供体基因型纯合率、(f)覆盖目标基因的杂合片段大小，并将群体中每个个体依据全基因组杂合率排序。同时，该模块通过对目标位点的基因型是否符合两个条件进行判断可筛选出可用于杂交亲本的目标材料，两个条件是：目标位点为杂合(基因型分别来自父本和母本)、目标位点所在的杂合片段小于等于2mb。

步骤2.4、利用步骤2.2的基因型模拟模块和步骤2.3的材料选择模块，模拟bcnf1代基因型，选择1个数量性状位点基因作为目标基因，统计是否出现可用于自交的目标材料，该材料需要符合以下条件：目标片段为杂合基因型、目标位点所在杂合片段长度小于等于2m、基因组中除目标位点所在的杂合片段外的其它区域为纯合的受体基因型。将模拟重复1000次，统计1000次模拟上bcnf1代出现自交目标材料的次数作为获得自交目标材料的概率。统计时假定每一代群体包含的子代材料数为1000，分别评估每一代选择基因组杂合率最低、目标片段最小、杂合片段最少、重组断点最少时获得自交目标材料的概率(图2a)。评估后发现每一代选择基因组杂合率最低即杂合片段占基因组比例最低的材料选择效率最高，因此设定在回交世代bcnf1中筛选基因组整体杂合率最低且目标基因区域为杂合基因型的个体，将其作为下一代bcn+1f1群体的亲本进行进一步的模拟。

进一步统计群体规模、每代选择的目标材料数、导入染色体片段大小、bc1f1-bc3f1群体规模的比例、选择的目标位点数量以及目标位点在染色体上的位置等参数对后代选择的成功率的影响。例如，设定每代群体大小分别为500、1000、1500、2000，评估群体规模对选择效率的影响(图2b)。设定每次模拟群体大小为1000个体，每个世代选择的候选子代个数分别为1个、5个、10个、20个，评估子代样本选择的数量对选择概率的影响(图2c)。设定每次模拟群体大小为1000个体，每个世代选择子代数量固定，评估不同目标片段大小(1mb、2mb、5mb、10mb)的选择概率(图2d)。固定bc1f1-bc3f1的群体总大小为6000个体，设定每代不同的个体数量比例为1:1:1、1:2:3、3:2:1、1:2:7、7:2:1，评估不同群体大小比例对于选择概率的影响(图2e)。固定每代群体大小，选择不同的基因数量(1-3个)，评估选择基因的数量对选择概率的影响(图2g)。分别选择基因组上不同位置(着丝粒、端粒、非着丝粒及端粒区)的基因与非着丝粒及端粒区基因进行组合(dth8/pi3、dth8/pid2、dth8/xa5)，评估基因组不同区域对选择效率的影响(图2f和图2h)。结果表明群体规模越大、每代选择的材料数越少、导入片段越大、bc1f1-bc3f1群体的规模符合1:2:3、选择的目标位点数量越少、目标位点在染色体两端时能够更快速的选择得到符合要求的目标材料。以上结果可作为用户设计回交育种路线的参考因素。

步骤2.5、根据步骤2.4的模拟结果，对水稻分子导航育种程序的材料选择模块进行修正，选择目标后代材料需要对目标位点的基因型是否符合目标位点为杂合及基因组杂合率最低进行判断，输出基因组杂合率最低且目标位点杂合的5个材料供用户选择，输出信息还包括重组断点数量、杂合片段数量、供体基因型纯合率、覆盖目标基因的杂合片段大小等信息，用于辅助用户筛选出最佳杂交亲本(杂合片段少、重组断点较少、无供体基因等)和是否出现可用于自交的亲本(杂合片段较小、杂合片段数与改良位点数相等、无供体基因)。

实施例3水稻分子导航育种中的具体模拟过程

步骤3.1、收集水稻数量性状基因功能变异位点信息(这里直接采用实施例1中已经收集的位点信息)，将所述数量性状基因功能变异位点的序列和位置信息还原到参考基因组上，去除连锁及冗余位点，构建水稻数量性状基因关键功能变异位点图谱。

步骤3.2、对改良目标品种进行深度测序(大于60×)，获得二代测序序列。利用水稻分子导航育种程序的关键功能变异位点选择模块，将序列与日本晴基因组(msuv7.0)比对，基于比对结果确定测序的水稻材料的变异位点，将所获得的变异位点与水稻数量性状基因关键功能变异位点图谱进行比对，获得遗传改良的目标位点，根据育种目标从中选择不超过4个位点进行遗传改良。

步骤3.3、用户选择供体材料和改良的目标位点后，设置每个世代水稻群体的大小、回交次数、模拟次数等。利用水稻分子导航育种程序的模拟模块对bcnf1代获得目标材料的概率(指的是当代获得满足所设定条件后代材料的模拟次数占总模拟次数的比值)进行预测，用户根据预测结果调整回交次数和每个世代的水稻群体规模。

步骤3.4、用户根据步骤3.2的结果，选择携带目标位点的材料作为供体亲本与改良目标品种进行杂交，根据步骤3.3得到的回交次数和回交群体规模进行回交。对回交得到的后代群体进行低覆盖的基因组测序(测序深度0.5-5×)，将测序结果导入水稻分子导航育种程序的材料选择模块中(即上述步骤2.5中实现的功能)，筛选出自交亲本，若无理想的自交亲本，从中选择1个理想的杂交亲本进行回交并重复上述过程直至出现理想的自交亲本。

获得自交亲本后，将材料自交，利用分子标记从自交后代bcnf2中筛选出目标数量性状位点全部为纯合供体基因型的材料即为最终的改良材料(图3)。

实施例4水稻分子导航育种技术应用于优异供体种质筛选

本实施例中，将利用水稻分子导航育种技术应用于筛选水稻分子育种所需的优异供体种质。

步骤4.1、提取水稻自然群体材料的dna后进行重测序(测序深度为覆盖水稻基因组10-20×)，获得相应测序结果。

步骤4.2、将测序获得的短读长序列比对到日本晴基因组(msuv7.0)上，并得到包含变异位点的变异文件。

步骤4.3、将水稻数量性状基因关键功能变异位点利用水稻分子导航的关键变异位点选择模块比对到变异文件中，提取相应的变异位点(图4a)。

步骤4.4、根据水稻数量性状基因关键功能变异位点的遗传效应，选择其中可以明确增加产量、提高品质、增强抗性的变异位点和携带这些优异变异类型的种质资源作为水稻品种遗传改良的供体。例如，10份水稻材料中的lax1基因编码区发生了c到a的突变，导致氨基酸改变，造成水稻的每穗粒数增加、产量提高(图4b)；7份水稻材料的pi9基因在编码区发生c到t突变，造成水稻稻瘟病抗性提高(图4c)。

实施例5水稻分子导航育种技术应用于“黄华占”的分子育种

本实施例中，将对本发明应用于“黄华占”的分子育种进行详细描述。

步骤5.1、提取水稻品种“黄华占”dna后用tn5转座酶法建库，进行高覆盖重测序(测序深度为覆盖水稻基因组60×以上)，获得相应测序结果。将测序获得的短读长序列比对到日本晴基因组(msu7.0)上，并得到包含变异位点的变异文件。将水稻数量性状基因因果变异位点比对到变异文件中，提取相应的变异位点。利用水稻导航育种程序的关键变异位点选择模块(上述步骤2.1所实现的功能)对变异位点进行分析发现“黄华占”基因组中ossoc1、tac1和badh2三个数量性状位点基因可被改良，而水稻数量性状关键功能变异位点库中的材料basmati携带3个优良等位，可被选为“黄华占”的遗传改良供体(图5a)。

步骤5.2、按照上面实施例中的方法制定了“黄华占”分子改良的策略并实施：将黄华占与basmati杂交后，获得5株f1，继续与“黄华占”进行连续三代回交，每一代都对回交群体进行低覆盖的基因组测序(0.5-5×)，利用水稻分子导航育种程序的材料选择模块筛选全基因组无纯合供体片段、导入的数量性状位点为杂合、基因组杂合率最低的5-10株材料作为杂交亲本进行回交，获得足量的杂交种，bc1f1、bc2f1、bc3f1种植株系分别为大461株、908株、1190株。利用水稻导航育种程序的材料选择模块筛选出bc3f1株系中杂合率最低、导入片段最短的3个株系作为自交材料，将3个株系的8000株自交后代种植在大田中。利用分子标记从8000株bc3f2材料中筛选出目标位点纯合且无其他导入片段的株系21株，导入片段最短的株系k9-172-15-73的导入片段平均长度为3.3mb(图5b)。

步骤5.3、将改良后的21株“黄华占”和48株“黄华占”种植在大田中，考察抽穗期、香味、株型和产量等表型，结果表明改良“黄华占”与“黄华占”相比，抽穗期提前3天、分蘖角度降低9度、有明显的香味、单株产量无明显差异，成功实现了“黄华占”抽穗期、株型和品质的改良提高(图5c-f)。

本实施例中使用了水稻分子导航育种技术对国内近年来推广面积较大的籼稻品种“黄华占”进行了soc1、tac1和badh2基因的遗传改良，仅回交3代，回交群体总株数小于3000株，导入片段小于5mb，且无多余导入片段。如果采用传统育种方法，同时改良3个性状，需要回交5代以上，导入片段较大且易引入其他片段引入新的连锁累赘。如果采用普通的分子标记辅助育种技术，需要回交4代以上。如果采用与本发明类似的基因组测序进行后代材料筛序，但是bc1f1、bc2f1、bc3f1种植株系不符合1:2:3的比例，则在bc3f2代完成目标材料筛选的可能性降低5％-25％不等。因此，与其他水稻育种方法相比，本发明提供的水稻分子导航育种技术具有显著提高水稻育种效率的优点。

虽然上面结合本发明的优选实施例对本发明的原理进行了详细的描述，本领域技术人员应该理解，上述实施例仅仅是对本发明的示意性实现方式的解释，并非对本发明包含范围的限定。实施例中的细节并不构成对本发明范围的限制，在不背离本发明的精神和范围的情况下，任何基于本发明技术方案的等效变换、简单替换等显而易见的改变，均落在本发明保护范围之内。

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