一种适用于长效脑卒中治疗药物评价的大鼠缺血模型的构建方法与流程_大鱼知产
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一种适用于长效脑卒中治疗药物评价的大鼠缺血模型的构建方法与流程

发布者:大鱼知产 点击: 发布时间:2021-03-21
一种适用于长效脑卒中治疗药物评价的大鼠缺血模型的构建方法与流程

本专利涉及新药研发、药效评价技术和实验动物技术领域,特别涉及一种适用于长效脑卒中治疗药物评价的大鼠缺血模型的构建。

技术背景

脑卒中是影响全球人类健康的重大疾病之一,它具有较高的发病率、致残率和死亡率。脑卒中的发病机制相当复杂,按其机制的不同可以分为缺血性和出血性,缺血性卒中的发病率高于出血性卒中,占脑卒中总数的60%~70%。我国每年脑卒中新发约250万人,每年死于脑卒中患者约150万人,目前我国有致残卒中患者2000万人。在临床上仅有不到5%的卒中患者能够在急性期得到有效的溶栓治疗。

急性缺血性脑卒中早期,梗死核心边缘存在脑血流量减低区域,称为缺血半暗带。该区域脑组织功能受损,但仍保持结构的完整性,期内神经元未完全死亡,而是处于功能减弱的状况。对于错过溶栓时机的急性脑卒中患者的治疗,首先是应尽快开启侧支循环,侧支循环的改善可带来微循环灌注的改善,保护微循环结构和功能。一方面直接通过增加梗死区微循环的灌注,并提高微循环结构的缺血耐受,从而减轻微循环障碍;另一方面可使干预药物最大限度抵达缺血区,提高治疗效果。临床数据显示,对于颅内动脉严重狭窄或闭塞所致的急性缺血性卒中患者,有侧支循环的预后明显优于无侧支循环者;患者侧支循环的程度与90天功能预后密切相关。

脑卒中患者的康复治疗长达6~18个月,在这个过程中各类能够改善脑血循环的药物特别是长效药物均有可能用于缺血性脑卒中的临床治疗中,也是近期这类药物研发的重点,然而脑卒中动物模型,特别是适用于长效抗脑卒中药物评价动物模型的缺乏一直是这一工作的难点之一。常用的脑缺血动物模型主要包括:线栓法、光栓法、血栓栓塞法、微球注入法、改良血栓法、家兔脑缺血模型、猴脑缺血模型,以及以转基因动物为基础制备的自发性脑缺血模型。其中光栓法的主要原理是用全身给药的方式腹腔注入玫瑰红染料然后对大鼠的头颅局部位置进行光照从而激活光化学反应,光照激活玫瑰红染料形成自由激进分子形式,导致破坏内皮细胞的功能以及在脑皮质的血管中形成局部血栓。光栓法不是阻塞某一动脉,而是引起大脑皮层中某一特定区域中的微血管阻塞,其形成的脑梗死会产生长期的感觉运动障碍,因此该方法可用于探究慢性卒中的长期功能恢复。其优点在于,实验过程简单,创伤较小,具有较高的重现性和较低的死亡率。,然而光源的强度、波长等条件是影响模型状态的重要条件,也是制约这一模型稳定性和应用的因素。



技术实现要素:

本发明目的在于提供一种更适合长效脑卒中治疗药物评价的动物模型。

本发明的大鼠缺血模型构建方法:大鼠全身性给予光敏染料玫瑰红,然后利用特定波长的冷光源光照射脑部,引起脑组织的缺血性损伤。

作为优选,所述大鼠是体重240~280g的sd雄性大鼠。

作为优选,所述冷光源的光照强度是1.6×105~1.8×105lx。

作为优选,所述冷光源的光照波长是570nm。

作为优选,所述冷光源的光照时间是8min~12min。

本申请制备的大鼠模型缺血性脑卒中的症状的典型性、模型的稳定性和均一性。更适合用于长效脑卒中药物的药效评价。

附图说明

图1:实施例1动物不同体重对大鼠运动皮层缺血模型的影响。a:各组动物胶布移除时间比(%);b:各组动物左前肢失足率(%);c:各组动物脑梗死体积(mm3);d:各组动物死亡率(%)。

图2:实施例4长效激肽原酶在大鼠运动皮层缺血模型上的有效性评价。a:各组脑组织切片尼氏染色结果;b:各组动物胶布移除时间比(%);c:各组动物左前肢失足率(%);d:各组动物脑梗死体积(mm3)。*表示与模型组相比差异显著(p<0.05)。

具体实施例

实施例1

1.实验动物:sprague-dawley(sd)大鼠,雄性,spf级,体重180~220g15只,240~280g15只,300~340g15只由上海斯莱克实验动物责任有限公司提供,许可证号:scxk(沪)2017-0005。环境温度20~26℃,湿度40%~70%。12小时交替光照,自由采食、饮水。spf级全价颗粒鼠粮,由江苏协同医药生物工程有限责任公司提供。

2.仪器耗材:立体定位仪(davidkopfinstruments)、冷光源(worldprecisioninstruments)、水合氯醛(国药化试)、玫瑰红(西格玛奥德里奇)、尼氏染色液(碧云天)

3.方法

3.1模型制备:选择体重范围在180~220g、240~280g、300~340g的sd大鼠各15只用10%水合氯醛麻醉后,将其固定于立体定位仪上,消毒皮肤,沿其脑部正中线剪开皮肤暴露出头盖骨,用无菌棉花擦干,找到并标记前卤点和λ点,读取前卤点和λ点的d值,调整使前卤点和λ点的d值不超过0.2mm。将直径为8.0mm的冷光源出光孔定位于前卤点向右4.0mm处。在大鼠左或右侧股静脉注射玫瑰红(10mg/kg;10mg/ml);2min后用光强为2.0×105lx的冷光源照射10min;移除光纤,消毒,缝合头部皮肤,放回笼中饲养。

3.2感觉运动功能评价:缺血损伤7天后对动物进行胶布移除实验和网格实验。胶布移除实验:将3cm×1cm的胶带缠绕在其损伤测前肢(左前肢),确保胶带不会被鼠移除,记录30s内大鼠用嘴或前肢企图移除胶布的时间;去除胶布,10min后测其未损伤测前肢(右前肢)企图移除胶布的时间;左、右前肢各测定3次,取平均值,计算左前肢/右前肢企图移除胶布时间的百分比,比值越大,说明大鼠感觉运动功能越协调,比值越小,协调性越差,运动皮层损伤越严重。网格实验:将每只鼠单独放在网眼大小为30×30mm的网格,让其自发活动5min,纪录大鼠左前肢的失足步数和总步数,计算失足步数和总步数之间的百分率。

3.3脑梗死体积的测定:完成感觉运动功能评价后,动物处以安乐死,取出脑组织,4%多聚甲醛溶液固定,梯度蔗糖溶液脱水后,缺血损伤部位行冰冻切片,每0.5mm取一片,pbs清洗后转移至载玻片,自然晾干后进行尼氏染色。显微镜下观察,拍照。圈定右侧缺血面积(深紫色区域),脑梗死体积(mm3)=缺血总面积(mm2)×厚度(0.5mm)。

4结果:

体重为180~220gsd大鼠制备的大鼠运动皮层缺血模型的脑卒中症状较重,胶布移除时间比、左前肢失足率、脑梗死体积均高于240~280g组和300~340g组的动物,同时2/15的动物是实验过程中出现死亡;体重为300~340gsd大鼠制备的大鼠运动皮层缺血模型的脑卒中症状较轻,组内动物个体差异较大,部分动物缺血性脑卒中的症状不明显;体重为240~280gsd大鼠制备的大鼠运动皮层缺血模型的脑卒中症状的严重程度适宜,胶布移除时间比、左前肢失足率、脑梗死体积均在合理范围内,组内动物个体差异较小。详见表1、图1。

表1动物不同体重对大鼠运动皮层缺血模型的影响

依据以上结果,在建立大鼠运动皮层缺血模型的过程中,将大鼠的体重优化为240~280g保证了缺血性脑卒中的症状的典型性、模型的稳定性和均一性。

实施例2

1.实验动物:sprague-dawley(sd)大鼠,雄性,spf级,体重240~280g80只,由上海斯莱克实验动物责任有限公司提供,许可证号:scxk(沪)2017-0005。环境温度20~26℃,湿度40%~70%。12小时交替光照,自由采食、饮水。spf级全价颗粒鼠粮,由江苏协同医药生物工程有限责任公司提供。

2.仪器耗材:立体定位仪(davidkopfinstruments)、冷光源(worldprecisioninstruments)、水合氯醛(国药化试)、玫瑰红(西格玛奥德里奇)、尼氏染色液(碧云天)

3.方法

3.1模型制备:选择体重范围在240~280g的sd大鼠各80只用10%水合氯醛麻醉后,将其固定于立体定位仪上,消毒皮肤,沿其脑部正中线剪开皮肤暴露出头盖骨,用无菌棉花擦干,找到并标记前卤点和λ点,读取前卤点和λ点的d值,调整使前卤点和λ点的d值不超过0.2mm。将直径为8.0mm的冷光源出光孔定位于前卤点向右4.0mm处。在大鼠左或右侧股静脉注射玫瑰红(10mg/kg;10mg/ml);2min后用光强为1.4×1051.6×1051.8×1052.0×1052.0×105lx的白光,或光强为1.4×1051.6×1051.8×1052.0×1052.0×105lx的绿光(570nm)照射10min;移除光纤,消毒,缝合头部皮肤,放回笼中饲养。

3.2脑梗死体积的测定:完成感觉运动功能评价后,动物处以安乐死,取出脑组织,4%多聚甲醛溶液固定,梯度蔗糖溶液脱水后,缺血损伤部位行冰冻切片,每0.5mm取一片,pbs清洗后转移至载玻片,自然晾干后进行尼氏染色。显微镜下观察,拍照。圈定右侧缺血面积(深紫色区域),脑梗死体积(mm3)=缺血总面积(mm2)×厚度(0.5mm)。

4结果:

当将光源条件优化为强度为1.6×105~1.8×105lx的绿光(570nm)时,脑梗死体积分别为,30.92±2.89mm3和32.57±2.29mm3,与其他光源条件的组相比,大鼠运动皮层缺血模型的脑卒中症状的严重程度适宜,脑梗死体积均在合理范围内,组内动物个体差异较小。详见表2。

表2不同光源条件对大鼠运动皮层缺血模型的影响

依据以上结果,在建立大鼠运动皮层缺血模型的过程中,将光源条件优化为强度为1.6×105~1.8×105lx的绿光(570nm),保证了缺血性脑卒中的症状的典型性、模型的稳定性和均一性。

实施例3

1.实验动物:sprague-dawley(sd)大鼠,雄性,spf级,体重240~280g60只,由上海斯莱克实验动物责任有限公司提供,许可证号:scxk(沪)2017-0005。环境温度20~26℃,湿度40%~70%。12小时交替光照,自由采食、饮水。spf级全价颗粒鼠粮,由江苏协同医药生物工程有限责任公司提供。

2.仪器耗材:立体定位仪(davidkopfinstruments)、冷光源(worldprecisioninstruments)、水合氯醛(国药化试)、玫瑰红(西格玛奥德里奇)、尼氏染色液(碧云天)

3.方法

3.1模型制备:选择体重范围在240~280g的sd大鼠各80只用10%水合氯醛麻醉后,将其固定于立体定位仪上,消毒皮肤,沿其脑部正中线剪开皮肤暴露出头盖骨,用无菌棉花擦干,找到并标记前卤点和λ点,读取前卤点和λ点的d值,调整使前卤点和λ点的d值不超过0.2mm。将直径为8.0mm的冷光源出光孔定位于前卤点向右4.0mm处。在大鼠左或右侧股静脉注射玫瑰红(10mg/kg;10mg/ml);2min后用光强为1.6×105lx的绿光(570nm)照射6~16min;移除光纤,消毒,缝合头部皮肤,放回笼中饲养。

3.2脑梗死体积的测定:完成感觉运动功能评价后,动物处以安乐死,取出脑组织,4%多聚甲醛溶液固定,梯度蔗糖溶液脱水后,缺血损伤部位行冰冻切片,每0.5mm取一片,pbs清洗后转移至载玻片,自然晾干后进行尼氏染色。显微镜下观察,拍照。圈定右侧缺血面积(深紫色区域),脑梗死体积(mm3)=缺血总面积(mm2)×厚度(0.5mm)。

4结果:

当将光照时间优化为强度为1.6×105lx的绿光(570nm)照射8~12min时,脑梗死体积分别为,29.57±3.22mm3、30.92±2.89mm3和32.01±3.04mm3,与其他光照时间组相比,大鼠运动皮层缺血模型的脑卒中症状的严重程度适宜,脑梗死体积均在合理范围内,组内动物个体差异较小。详见表3。

表3不同光照时间对大鼠运动皮层缺血模型的影响

依据以上结果,在建立大鼠运动皮层缺血模型的过程中,当将光照时间优化为强度为1.6×105lx的绿光(570nm)照射8~12min,保证了缺血性脑卒中的症状的典型性、模型的稳定性和均一性。

实施例4

1.实验动物:sprague-dawley(sd)大鼠,雄性,spf级,体重240~280g45只,由上海斯莱克实验动物责任有限公司提供,许可证号:scxk(沪)2017-0005。环境温度20~26℃,湿度40%~70%。12小时交替光照,自由采食、饮水。spf级全价颗粒鼠粮,由江苏协同医药生物工程有限责任公司提供。

2.仪器耗材:立体定位仪(davidkopfinstruments)、冷光源(worldprecisioninstruments)、水合氯醛(国药化试)、玫瑰红(西格玛奥德里奇)、尼氏染色液(碧云天)

3.方法

3.1模型制备:sd大鼠各用10%水合氯醛麻醉后,将其固定于立体定位仪上,消毒皮肤,沿其脑部正中线剪开皮肤暴露出头盖骨,用无菌棉花擦干,找到并标记前卤点和λ点,读取前卤点和λ点的d值,调整使前卤点和λ点的d值不超过0.2mm。将直径为8.0mm的冷光源出光孔定位于前卤点向右4.0mm处。在大鼠左或右侧股静脉注射玫瑰红(10mg/kg;10mg/ml);2min后进行光源照射。传统模型组的光照条件为:光强为2.0×105的白光照射10min;优化模型组的光照条件为:光强为1.6×105lx的绿光(570nm)照射10min;移除光纤,消毒,缝合头部皮肤,放回笼中饲养。伪手术组麻醉后,仅沿其脑部正中线剪开皮肤暴露出头盖骨,消毒,缝合头部皮肤,放回笼中饲养。

3.2给药:缺血2h后给药组动物按照100iu/kg肌肉注射长效激肽原酶(聚乙二醇修饰的klk1,制备方法可参考cn201310745409.1、cn201710699360.9等),给药体积为1ml/kg,伪手术组和模型组肌肉注射同等体积的生理盐水。

3.3感觉运动功能评价:缺血损伤7天后对动物进行胶布移除实验和网格实验。胶布移除实验:将3cm×1cm的胶带缠绕在其损伤测前肢(左前肢),确保胶带不会被鼠移除,记录30s内大鼠用嘴或前肢企图移除胶布的时间;去除胶布,10min后测其未损伤测前肢(右前肢)企图移除胶布的时间;左、右前肢各测定3次,取平均值,计算左前肢/右前肢企图移除胶布时间的百分比,比值越大,说明大鼠感觉运动功能越协调,比值越小,协调性越差,运动皮层损伤越严重。网格实验:将每只鼠单独放在网眼大小为30×30mm的网格,让其自发活动5min,纪录大鼠左前肢的失足步数和总步数,计算失足步数和总步数之间的百分率。

3.4脑梗死体积的测定:完成感觉运动功能评价后,动物处以安乐死,取出脑组织,4%多聚甲醛溶液固定,梯度蔗糖溶液脱水后,缺血损伤部位行冰冻切片,每0.5mm取一片,pbs清洗后转移至载玻片,自然晾干后进行尼氏染色。显微镜下观察,拍照。圈定右侧缺血面积(深紫色区域),脑梗死体积(mm3)=缺血总面积(mm2)×厚度(0.5mm)。

4结果:

在传统模型和优化模型上,缺血2h后肌肉注射长效激肽原酶药物可引起动物感觉运动功能的改善和脑梗死体积的较少,与模型组相比,胶布移除时间比、左前肢失足率、脑梗死体积均有显著改善。长效激肽原酶药物在优化模型上引起相应症状改善的程度大于在传统模型上引起的症状改善程度。详见表4、图2。

表4激肽原酶在大鼠运动皮层缺血模型上的有效性评价

注:*表示与模型组相比差异显著(p<0.05)。

依据以上结果,优化的大鼠运动皮层缺血模型的缺血性脑卒中的症状的典型性、模型的稳定性、均一性和重复性均有了明显的改善。更适合用于长效抗脑卒中药物的药效评价。

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