一种中日照品种洋葱大孢子单倍体的培养方法与流程

本发明属于洋葱育种技术领域，具体地说是一种利用洋葱花蕾培养、诱导洋葱雌配子体向孢子体途径转化再生成单倍体植株以加快洋葱育种进程、缩短杂交种育种年限的中日照品种洋葱大孢子单倍体的培养方法。

背景技术：

洋葱（alliumcepal.，染色体数2n=2x=16）目前是世界上栽培面积最大的蔬菜作物之一，在我国栽培面积增长迅速，为农民重要出口创收蔬菜。由于我国引进洋葱栽培时间短，种植资源相对稀少，市场上主栽洋葱大多为国外进口品种，种子价格十分昂贵。因此实现品种自主、摆脱进口依赖、降低农户种植成本成为目前发展我国洋葱产业发展的迫切需求。优良的洋葱常规及杂交品种要求整齐一致，这主要取决于常规材料及亲本自交系的纯合程度。洋葱异化授粉特点明显，通常3代自交即开始出现明显性状退化问题，品种选育周期达6～10年。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷，提供一种利用洋葱花蕾培养、诱导洋葱雌配子体向孢子体途径转化再生成单倍体植株以加快洋葱育种进程、缩短杂交种育种年限的中日照品种洋葱大孢子单倍体的培养方法；该培养方法利用外包萼片及花瓣去除、低温刺激、激素配比诱导、花梗营养长度控制、培养瓶培养以降低污染率、提高洋葱大孢子单倍体培养出苗率，达到加快洋葱育种进程、缩短杂交种育种年限目的。

本发明的目的是通过以下技术方案解决的：

一种中日照品种洋葱大孢子单倍体的培养方法，其特征在于：该方法步骤如下：

a、5月份洋葱抽薹时架设防虫隔离网，选择已开放个别花蕾的花球并剪取带3～5cm花葶的花球，塑料袋包装后放入冰箱冷藏预处理；

b、在ms基础培养基中加入2mg/l的2，4-d＋2mg/l的6-ba＋100g/l的蔗糖＋7g/l的琼脂、用1%naoh调其ph值至5.8～6.1配制成ms诱导培养基，并将ms诱导培养基倒入培养瓶后进行灭菌处理；

c、从冰箱取出预处理的花球，选择花球中的未开放花蕾，用镊子摘除未开放花蕾的上萼片及花瓣且切留2～3mm花梗后，包裹入纱布流动净水冲洗；

d、超净工作台中对冲洗后的花蕾消毒后用滤纸吸干水分，镊子夹取花蕾插入步骤b灭菌处理后的ms诱导培养基中，每个培养瓶插植13～17个花蕾，完成后放置在组培室中培养；

e、组培室中培养70～90天，移入新的ms诱导培养基中进行继代移植培养；

f、在b5基础培养基中加入30g/l蔗糖＋7g/l琼脂、用1%naoh调其ph值至5.8～6.1配制成b5再生培养基，并将b5再生培养基倒入培养瓶后进行灭菌处理；

g、待继代移植培养的花蕾产生胚状体后，将胚状体移入步骤f灭菌处理后的b5再生培养基中，每个培养瓶插植3～6个产生胚状体的花蕾，完成后放置在组培室中培养；

h、胚状体发育成再生植株后，取植株叶片并用流式细胞仪检测倍性，验证单倍体植株并移至装有基质的营养钵中，在玻璃室中驯化培养至单倍体植株正常生长后移栽至室外大田。

所述步骤a中的冰箱冷藏预处理的冷藏温度为0～4℃、预处理时间为5～7天。

所述步骤b和步骤f中的灭菌处理的过程为：将配制好的ms诱导培养基或b5再生培养基倒入对应的带有透气孔盖的培养瓶，培养瓶拧盖后放入120℃的高压锅内灭菌20～30min。

每个培养瓶中倒入30～50ml的ms诱导培养基或b5再生培养基，培养瓶的规格为240ml。

所述步骤c中的未开放花蕾的挑选标准为花蕾直径达3～5.5mm。

所述步骤c中的流动净水冲洗时间为20～30min。

所述步骤d中的花蕾消毒方法为：先用70%酒精消毒20～30s，取出超纯无菌水流动冲洗2～3次；再放入10%浓度次氯酸钠溶液消毒7～10min，超纯无菌水冲洗2～3次。

所述步骤d、步骤e、步骤g中的组培室的室内条件设置为恒温25℃、光强30～35umol/m2/s、光照时间16～20h/d。

所述步骤h中的再生植株生长至3叶一心后取植株叶片并用流式细胞仪检测倍性，验证单倍体植株并移至装有基质的营养钵中，在玻璃室中驯化培养20～30天，4～5叶一心完成驯化移栽至室外大田。

所述步骤h中的单倍体植株在室外大田中生长时，需要观察植株开花结子情况并再次验证单倍性。

本发明相比现有技术有如下优点：

本发明的方法利用外包萼片及花瓣去除、培养瓶培养方法，能够有效降低培养污染率，控制污染率不超过14%；利用低温刺激、花梗营养长度控制、激素配比诱导方法，提高洋葱大孢子单倍体诱导出苗率，不同品种类型洋葱诱导出苗率达到2～5%；该方法不但能有防止洋葱隐性优势基因流失并对其作用表现加以有效利用，还能达到加快洋葱育种进程、缩短杂交种育种年限目的；且单倍体材料加倍获得的双单倍体植株，由于基因完全纯合特点，还是特异遗传性状研究分析、全基因组测序及分子标记开发的理想材料。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

一种中日照品种洋葱大孢子单倍体的培养方法，其特征在于：该方法步骤如下：

a、5月份洋葱抽薹时架设防虫隔离网，选择已开放个别花蕾的花球并剪取带3～5cm花葶的花球，塑料袋包装后放入0～4℃的冰箱冷藏预处理5～7天；

b、按照每1l的ms基础培养基中加入2mg/l的2，4-d＋2mg/l的6-ba＋100g/l的蔗糖＋7g/l的琼脂、用1%naoh调其ph值至5.8～6.1配制成ms诱导培养基，并将ms诱导培养基倒入带有透气孔盖的240ml规格的培养瓶，每个培养瓶中倒入30～50ml的ms诱导培养基，培养瓶拧盖后放入120℃的高压锅内灭菌处理20～30min；

c、从冰箱取出预处理的花球，选择花球中的直径达3～5.5mm的未开放花蕾，用镊子摘除未开放花蕾的上萼片及花瓣且切留2～3mm花梗后，包裹入纱布流动净水冲洗20～30min；

d、在超净工作台上，花蕾放入70%酒精消毒20～30s，取出超纯无菌水冲洗2～3次，再放入10%浓度次氯酸钠溶液消毒7～10min，超纯无菌水冲洗2～3次，用滤纸吸干水分；镊子夹取花蕾插入步骤b灭菌处理后的ms诱导培养基中，每个培养瓶插植13～17个花蕾，完成后放置在组培室中培养，组培室的室内条件设置为恒温25℃、光强30～35umol/m2/s、光照时间16～20h/d；

e、组培室中培养70～90天，在超净工作台内移入新的灭菌处理后的ms诱导培养基中进行继代移植培养，组培室的室内条件设置为恒温25℃、光强30～35umol/m2/s、光照时间16～20h/d；

f、在b5基础培养基中加入30g/l的蔗糖＋7g/l的琼脂、用1%naoh调其ph值至5.8～6.1配制成b5再生培养基，并将b5再生培养基倒入带有透气孔盖的240ml规格的培养瓶，每个培养瓶中倒入30～50ml的b5再生培养基，培养瓶拧盖后放入120℃的高压锅内灭菌处理20～30min；

g、待继代移植培养的花蕾产生胚状体后，将胚状体移入步骤f灭菌处理后的b5再生培养基中，每个培养瓶插植3～6个胚状体，完成后放置在组培室中培养；组培室的室内条件设置为恒温25℃、光强30～35umol/m2/s、光照时间16～20h/d；

h、胚状体发育成的再生植株生长至3叶一心后取植株叶片并用流式细胞仪检测倍性，验证单倍体植株并移栽至装有基质的营养钵中，先在玻璃室中驯化培养20～30天，待植株生长至4～5叶一心后移栽至自然大田，在自然大田中观察植株开花结子情况并再次验证单倍性。

上述方法中，单倍体培养过程所有实验用具需经高压锅120℃灭菌20min以上，以防造成材料污染，超净工作台需开紫外线通风灭菌20min以上，实验需在超净工作台中严格按照无菌操作进行。

上述方法中，花蕾的花梗需切留长度为2～3mm，过短易产生愈伤，过长营养经花梗吸收运输不足，降低花蕾生出单倍体的胚数。

上述方法中，花蕾诱导培养周期时间长，生长过程易出现污染问题，需用240ml培养瓶且每个培养瓶至少装入30～50ml含有2mg/l的2，4-d＋2mg/l的6-ba＋100g/l的蔗糖＋7g/l的琼脂、用1%naoh调其ph值至5.8～6.1的ms诱导培养基，为胚状体诱导提供充足养分及降低污染率。

本申请中的ms基础培养基可以选用市场上售卖的任意一家厂商生产的ms基础培养基，如北京西美杰生产的ms基础培养基。

本申请中的b5基础培养基可以选用市场上售卖的任意一家厂商生产的b5基础培养基，如索莱宝生产的b5基础培养基。

实施例一黄皮中晚熟品种“连葱9号”大孢子单倍体培养

a、5月份洋葱抽薹时架设防虫隔离网，选择已开放个别花蕾的花球并剪取带3～5cm花葶的花球，塑料袋包装后放入4℃的冰箱冷藏预处理5天；

b、按照每1l的ms基础培养基中加入2mg/l的2，4-d＋2mg/l的6-ba＋100g/l的蔗糖＋7g/l的琼脂、用1%naoh调其ph值至5.8～6.1配制成ms诱导培养基，并将ms诱导培养基倒入带有透气孔盖的240ml规格的培养瓶，每个培养瓶中倒入50ml的ms诱导培养基，培养瓶拧盖后放入120℃的高压锅内灭菌处理20min；

c、从冰箱取出预处理的花球，选择花球中的直径达3～5.5mm的未开放花蕾，用镊子摘除未开放花蕾的上萼片及花瓣且切留2～3mm花梗后，包裹入纱布流动净水冲洗20min；

d、在超净工作台上，花蕾放入70%酒精消毒20～30s，取出超纯无菌水流动冲洗2次，再放入10%浓度次氯酸钠溶液消毒7～10min，超纯无菌水冲洗3次，用滤纸吸干水分；镊子夹取花蕾插入步骤b灭菌处理后的ms诱导培养基中，每个培养瓶插植15个花蕾，完成后放置在组培室中培养，组培室的室内条件设置为恒温25℃、光强30～35umol/m2/s、光照时间16h/d；

e、组培室中培养70-90天，在超净工作台内移入新的灭菌处理后的ms诱导培养基（步骤b中灭菌处理后的ms诱导培养基）中进行继代移植培养，采用灭菌处理后的培养瓶对应移入，组培室的室内条件设置为恒温25℃、光强为30～35umol/m2/s、光照时间16h/d；

f、在b5基础培养基中加入30g/l的蔗糖＋7g/l的琼脂、用1%naoh调其ph值至5.8～6.1配制成b5再生培养基，并将b5再生培养基倒入带有透气孔盖的培养瓶，每个规格240ml的培养瓶中倒入50ml的b5再生培养基，培养瓶拧盖后放入120℃的高压锅内灭菌处理20min；

g、待继代移植培养的花蕾产生胚状体后，将胚状体移入步骤f灭菌处理后的b5再生培养基中，每个培养瓶插植3个胚状体，完成后放置在组培室中培养；组培室的室内条件设置为恒温25℃、光强30～35umol/m2/s、光照时间16h/d；

h、胚状体发育成的再生植株生长至3叶一心后取植株叶片并用流式细胞仪检测倍性，验证单倍体植株并移栽至装有基质的营养钵中，先在玻璃室中驯化培养20～30天，待植株生长至4～5叶一心后移栽至自然大田，在自然大田中观察植株开花结子情况并再次验证单倍性。

实施例二紫皮中晚熟品种“连葱11号”单倍体培养

a、5月份洋葱抽薹时架设防虫隔离网，选择已开放个别花蕾的花球并剪取带3～5cm花葶的花球，塑料袋包装后放入3℃的冰箱冷藏预处理7天；

b、按照每1l的ms基础培养基中加入2mg/l的2，4-d＋2mg/l的6-ba＋100g/l的蔗糖＋7g/l的琼脂、用1%naoh调其ph值至5.8～6.1配制成ms诱导培养基，并将ms诱导培养基倒入带有透气孔盖的240ml规格的培养瓶，每个培养瓶中倒入40ml的ms诱导培养基，培养瓶拧盖后放入120℃的高压锅内灭菌处理20min；

c、从冰箱取出预处理的花球，选择花球中的直径达3～5.5mm的未开放花蕾，用镊子摘除未开放花蕾的上萼片及花瓣且切留2～3mm花梗后，包裹入纱布流动净水冲洗20min；

d、在超净工作台上，花蕾放入70%酒精消毒20～30s，取出超纯无菌水冲洗2次，再放入10%浓度次氯酸钠溶液消毒7～10min，超纯无菌水冲洗3次，用滤纸吸干水分；镊子夹取花蕾插入步骤b灭菌处理后的ms诱导培养基中，每个培养瓶插植13个花蕾，完成后放置在组培室中培养，组培室的室内条件设置为恒温25℃、光强30-35umol/m2/s、光照时间16h/d；

e、组培室中培养70～90天，在超净工作台内移入新的灭菌处理后的ms诱导培养基（步骤b中灭菌处理后的ms诱导培养基）中进行继代移植培养，采用灭菌处理后的培养瓶对应移入，组培室的室内条件设置为恒温25℃、光强30～35umol/m2/s、光照时间16h/d；

f、在b5基础培养基中加入30g/l的蔗糖＋7g/l的琼脂、用1%naoh调其ph值至5.8～6.1配制b5再生培养基，并将b5再生培养基倒入带有透气孔盖的240ml规格的培养瓶，每个培养瓶中倒入50ml的b5再生培养基，培养瓶拧盖后放入120℃的高压锅内灭菌处理20min；

g、待继代移植培养的花蕾产生胚状体后，将胚状体移入步骤f灭菌处理后的b5再生培养基中，每个培养瓶插植13个胚状体，完成后放置在组培室中培养；组培室的室内条件设置为恒温25℃、光强30umol/m2/s、光照时间16h/d；

h、胚状体发育成的再生植株生长至3叶一心后取植株叶片并用流式细胞仪检测倍性，验证单倍体植株并移栽至装有基质的营养钵中，先在玻璃室中驯化培养20～30天，待植株生长至4～5叶一心后移栽至自然大田，在自然大田中观察植株开花结子情况并再次验证单倍性。

本发明的方法利用外包萼片及花瓣去除、培养瓶培养方法，能够有效降低培养污染率，控制污染率不超过14%；利用低温刺激、花梗营养长度控制、激素配比诱导方法，提高洋葱大孢子单倍体诱导出苗率，不同品种类型洋葱诱导出苗率达到2～5%；该方法不但能有防止洋葱隐性优势基因流失并对其作用表现加以有效利用，还能达到加快洋葱育种进程、缩短杂交种育种年限目的；且单倍体材料加倍获得的双单倍体植株，由于基因完全纯合特点，还是特异遗传性状研究分析、全基因组测序及分子标记开发的理想材料。

以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。

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