一种芝麻离体再生培养方法以及百里香酚作为所用培养基添加剂的应用与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种芝麻离体再生培养方法，本发明还涉及百里香酚作为所用培养基中添加剂的应用。

背景技术：

在植物组织培养领域，芝麻是目前公认的属于组织培养困难的几种作物之一，迄今仍面临外植体容易褐化、组织培养周期长、重复性差、基因型依赖性强和植株再生频率低等一系列突出问题，不易获得完整的离体再生植株。因此，芝麻组织培养尚未有效地应用于芝麻的遗传改良，并且以此技术为基础的芝麻转基因研究也受到巨大限制。

目前，国内外虽有少数关于芝麻愈伤组织诱导及分化与植株再生获得成功的公开报道，但人们却很难对这些技术方法进行重复验证，而且植株再生频率也很低，一般仅为0.1%到10%左右。也有报道记载了利用从芝麻种子中剥取的子叶作为外植体进行离体培养，比较容易获得丛生芽的方法，但是该文作者却没有在后续的实践中成功加以应用。鉴于对该技术进行深入研究和应用的需要，当前迫切需要建立一套可靠而行之有效的芝麻离体再生的技术，以便满足芝麻遗传改良和生产发展的需求。

百里香酚(5-methyl-2-isopropylphenol；或者thymol)，又名麝香草酚，是一种天然存在于植物中的单萜酚类物质，具有广泛的杀菌、抗氧化、消炎、抗肿瘤和杀虫等活性，常用于制作香料、防腐剂、药物和指示剂等，但在植物组织培养领域中的应用却未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一种芝麻离体再生培养方法，为芝麻的遗传改良和进一步研究提供了新的技术思路。本发明还提供了百里香酚在植物组织培养基中的应用。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的一种芝麻离体再生培养方法，其中在愈伤组织的诱导及分化与再生幼苗的生根培养阶段所用的培养基中均添加有百里香酚，其具体培养方法包括下述步骤：

第一步，无菌苗培养

按1l的1/2ms（murashige&skoog）培养基中加入30g蔗糖,8g琼脂粉的比例配制生长培养基备用；

选取籽粒饱满的芝麻种子用乙醇和水清洗干净，再用配制的hgcl2溶液处理，然后用无菌水清洗干净后种植在生长培养基上置于培养室内培养6天，获得无菌苗；

第二步，切取子叶外植体

将第一步获得的无菌苗用手术刀切取子叶外植体，并保留2mm叶柄；

第三步，愈伤组织的诱导及分化

按1l的ms减铵培养基（这里是指不含硝酸铵的ms基础盐培养基）中加入6-苄基腺嘌呤2mg，萘乙酸0.1mg，百里香酚50mg，蔗糖30g，琼脂粉8g的比例，配制诱导及分化培养基备用；

将第二步切取的子叶外植体接种到诱导及分化培养基上，置于培养室内离体培养；培养过程中，首先可观察到外植体明显膨大，然后在子叶柄的伤口处出现愈伤组织，进而可看到分化产生的再生芽；当再生芽长到高度1cm左右时，切除未分化的外植体部分，仅保留带有愈伤组织的再生幼苗继续培养；在整个培养过程中，每两周进行一次继代培养；

第四步，再生幼苗的生根培养

按1l的ms培养基中加入吲哚丁酸0.5mg，百里香酚50mg，蔗糖30g，琼脂粉8g的比例配制生根培养基备用；

当再生幼苗生长到高度1.5-2.0cm时，转移到生根培养基上，置于培养室中诱导再生苗的生根，直至长成发达的根系，得到完整的再生植株。

所述生长培养基，诱导及分化培养基和生根培养基配制时，利用氢氧化钾调节ph值，培养基灭菌后的ph约为5.7-5.9。

第一步中无菌苗培养时，首先利用黑布遮光培养4天，然后去掉黑布继续培养2天；培养室内条件为：温度25±2℃；湿度65%；16h光照、8h黑暗交替进行，光照强度5000-6000lux。

本发明所述的百里香酚作为植物组织培养基添加剂的应用。具体来说，百里香酚作为植物组织培养基添加剂在促进和提高植物外植体的愈伤组织诱导及分化率与再生幼苗生根方面的应用。进一步的，百里香酚作为植物组织培养基添加剂在促进和提高芝麻外植体的愈伤组织诱导及分化率与再生幼苗生根方面的应用。

本发明的优点在于以芝麻幼苗的子叶为外植体材料，应用本发明配制的各培养阶段专用的培养基，建立了一种能快速、高效的促进和提高外植体的愈伤组织诱导及分化、再生幼苗生根的技术，该方法解决了当前芝麻组织培养中外植体容易褐化，培养周期长，重复性差，基因型依赖性强和植株再生频率低等一些突出的技术问题，有利于促进芝麻的遗传改良。

在本发明配制的诱导及分化培养基和生根培养基中，申请人创造性的添加了常用于制作香料、防腐剂、药物和指示剂等的百里香酚，显著的促进和提高了外植体的愈伤组织诱导及分化率，并促进和提高了对再生幼苗的诱导生根及其生长发育，为芝麻的快速繁殖、种质保存与创新以及转基因技术应用提供了一种可靠的技术方法。

附图说明

图1是切取的子叶外植体接种在本发明诱导及分化培养基（t）与对照培养基（c）上第1天的状态对比照片。

图2是子叶外植体接种在本发明诱导及分化培养基（t）与对照培养基（c）上第8天的状态对比照片。

图3是子叶外植体接种在本发明诱导及分化培养基（t）与对照培养基（c）上第10天的状态对比照片。

图4是子叶外植体接种在本发明诱导及分化培养基（t）与对照培养基（c）上第14天的状态对比照片。

图5是子叶外植体分别接种在本发明诱导及分化培养基（t）与对照培养基（c）上产生再生芽的统计结果对比。

图6是子叶外植体分别接种在本发明诱导及分化培养基（t）与对照培养基（c）上培养28天后所产生的再生幼苗的生长状态对比。

图7是再生幼苗分别转移到本发明生根培养基（rt）与对照生根培养基（rc）上诱导生根12天的生长状态对比。

图8是再生幼苗分别转移到本发明生根培养基（rt）与对照生根培养基（rc）上诱导生根14天的根系生长状态对比。

图9是移栽到土壤中生长的完整再生植株。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作更加详细的说明，以利于本领域技术人员的理解。

实施例1本发明的一种芝麻离体再生培养方法，包括下述具体步骤：

第一步，无菌苗培养

按1l的1/2ms培养基中加入30g蔗糖,8g琼脂粉的比例配制生长培养基备用；

选取籽粒饱满的芝麻种子60-70粒分装在1.5ml的eppendorf离心管中，加入1ml左右的70%乙醇，上下颠倒反复冲洗1min，弃掉废液，然后加入1ml的无菌水，冲洗1min，弃掉废液。加入1ml配制的0.1%hgcl2处理5min，弃掉废液，然后加入无菌水重复清洗5次。将处理好的种子种植在生长培养基上，置于培养室（16h光照/8h黑暗，温度25±2℃，湿度65%，光照强度5000-6000lux）中。先利用黑布进行遮光培养4天，然后去掉黑布继续培养2天，获得无菌苗；

第二步，切取子叶外植体

将第一步获得的无菌苗使用灭菌的手术刀切取子叶外植体，注意需要携带2mm左右叶柄；

第三步，愈伤组织的诱导及分化

按1l的ms减铵培养基中加入6-苄基腺嘌呤2mg，萘乙酸0.1mg，百里香酚50mg，蔗糖30g，琼脂粉8g的比例，配制诱导及分化培养基备用；

将第二步切取的子叶外植体接种到诱导及分化培养基上，置于第一步所用的培养室内进行离体培养。先利用黑布遮光培养8天，然后去掉黑布继续培养。一般培养1周左右即可观察到外植体明显膨大，10-12天在子叶柄的伤口处出现愈伤组织，大约2周可看到分化产生的再生芽。当再生芽生长到高度1cm左右时，切除未分化的外植体部分，仅保留带有愈伤组织的再生幼苗继续培养。在整个培养过程中，每两周进行一次继代培养。

第四步，再生幼苗的生根培养

按1l的ms培养基中加入吲哚丁酸0.5mg，百里香酚50mg，蔗糖30g，琼脂粉8g的比例配制生根培养基备用；

当再生幼苗生长到高度1.5-2.0cm时，转移到生根培养基上，仍置于第一步所用的培养室中诱导再生苗的生根，大约10天后即可长出发达的根系，形成完整的再生植株。

需要说明的是，生长培养基，诱导及分化培养基和生根培养基配制时，利用氢氧化钾调节ph值，培养基灭菌后的ph约为5.7-5.9。

实施例2探讨不同芝麻品种的子叶外植体的愈伤组织诱导率以及百里香酚的作用效果

按实施例1的方法，利用豫芝11号、豫芝4号、深芝11号和鄂芝7号等四个不同芝麻品种的种子进行消毒处理，在生长培养基上生长6天获得无菌苗，切取子叶外植体，接种到愈伤组织诱导及分化培养基上进行离体培养，并以未添加百里香酚的愈伤组织诱导及分化培养基（按1l的ms减铵培养基中加入6-苄基腺嘌呤2mg，萘乙酸0.1mg，蔗糖30g，琼脂粉8g的比例配制）作为对照；附图1为代表性品种材料（豫芝11号）刚切取的子叶外植体接种到本发明配制的愈伤组织诱导及分化培养基上和对照培养基上第1天的照片，两者相似。其中本发明配制的含有百里香酚的培养基标记为“t”，不含百里香酚的对照培养基标记为“c”。

附图2所示的是代表性品种材料（豫芝11号）的子叶外植体培养第八天的照片，从照片中可以看出，外植体明显膨大。

培养后第10-12天，在叶柄伤口处开始出现明显的愈伤组织。

附图3所示的是代表性品种材料（豫芝11号）的子叶外植体培养第10天的照片，可以看到外植体在含有百里香酚的培养基（t）上已开始在叶柄伤口处出现明显可见的块状愈伤组织（箭头指示），而在未添加百里香酚的对照培养基（c）上尚很难看到；此外，与t培养基相比，c培养基上的外植体在叶柄伤口处出现明显的褐色斑点，既褐化现象。

在培养后第14天，统计外植体的愈伤组织诱导率，豫芝11号、豫芝4号、深芝11号和鄂芝7号在含有百里香酚培养基（t）上的愈伤组织诱导率分别为93.16%，80.15%，87.68%和85.09%，而在对照培养基（c）上分别仅为59.46%，52.09%，54.68%和61.94%。

愈伤组织诱导率=（出现愈伤组织的外植体数/接种的外植体总数）×100%。

结论：添加百里香酚的培养基能够显著提高芝麻子叶外植体的愈伤组织诱导率。

实施例3探讨不同芝麻品种的子叶外植体的愈伤组织分化率以及百里香酚的作用效果

对实施例2中四个不同芝麻品种的愈伤组织分化情况进行观察分析，子叶外植体在本发明配制的含有百里香酚的愈伤组织诱导及分化培养基上培养12天左右开始分化出再生幼芽。当再生幼芽生长高度1cm左右时，切除未分化的外植体部分，仅保留带有愈伤组织的再生幼苗继续培养。在整个培养过程中，每两周进行一次继代培养。

分别统计各品种外植体在不同培养时间内的愈伤组织分化率[愈伤组织分化率=（分化出再生芽的外植体数/出现愈伤组织的外植体总数）×100%]，结果表明：豫芝11号、豫芝4号、深芝11号和鄂芝7号在含有百里香酚的培养基上培养14天时的分化率分别为20.06%，23.69%，10.15%和25.50%，而在对应的对照培养基上分别仅为3.31%，4.76%，4.90%和13.41%；培养24天时的分化率分别为32.51%，35.07%，26.39%和39.65%，而在对应的对照培养基上分别为25.05%，12.54%，19.71%和18.47%。

结论：百里香酚能够显著提高愈伤组织的分化率。

附图4是代表性品种材料（豫芝11号）的子叶外植体接种培养14天时的分化状况记录（拍照培养基的底部），可以看到外植体在含有百里香酚的培养基（t）上比在未添加百里香酚的对照培养基（c）上分化出数量更多、生长更快的再生幼芽（箭头指示），并且在叶柄伤口处发生褐化现象的程度（褐色斑点的大小和数量）明显减轻。

图5是代表性品种材料（豫芝11号）的子叶外植体分别接种在含有百里香酚的诱导及分化培养基（t）与未添加百里香酚的对照培养基（c）上，并统计在培养的不同时间内分化出再生幼苗的生长高度和数量，可以看出百里香酚对再生幼苗的分化和快速生长具有明显的促进作用。

图6是代表性品种材料（豫芝11号）的子叶外植体分别接种在含有百里香酚的诱导及分化培养基（t）与未添加百里香酚的对照培养基（c）上培养28天后，分别所产生的再生幼苗的生长状态比较，可以看出再生幼苗在t培养基上的生长高度明显大于c培养基。

实施例4百里香酚促进再生幼苗的生根和形成完整的再生植株

将实施例3中生长高度1.5-2.0cm的再生幼苗转移到本发明配制的生根培养基（rt）上诱导生根，并以未添加百里香酚的生根培养基（rc，按1l的ms培养基中加入吲哚丁酸0.5mg，蔗糖30g，琼脂粉8g的比例配制）为对照。

图7是代表性品种材料（豫芝11号）的再生幼苗分别转移到含有百里香酚的生根培养基（rt）与未添加百里香酚的对照生根培养基（rc）上诱导生根12天的生长状态，可以明显看到再生幼苗在rt培养基上已诱导生根（箭头指示），而在rc培养基上尚不可见。

图8是代表性品种材料（豫芝11号）的再生幼苗分别转移到含有百里香酚的生根培养基（rt）与未添加百里香酚的对照生根培养基（rc）上诱导生根14天的根系生长状态，可以看到再生幼苗在rt培养基上已形成发达的根系（箭头指示），而在rc培养基上生根不良。

结论：百里香酚能够促进再生幼苗的生根，并形成完整的再生植株。

附图9为移栽到土壤中生长的完整再生植株。

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